Метод определения мастита в молоке

Скрытый мастит у коров сопровождается вяло протекающим воспалительным процессом, при котором клинические признаки мастита выражены очень слабо, а то вообще не проявляются.

На крупных молочных комплексах подобная форма патологии широко распространена и практически ветспециалистами сельскохозяйственных предприятий обычно диагностируется во время проведения ежемесячных исследованиях дойного стада на скрытую форму мастита. При машинном доении скрытым маститом поражается до 15% лактирующих коров.

Этиология. Причины возникновения скрытых маститов разнообразны. В сельхозпредприятиях скрытые маститы наиболее часто возникают при несоблюдении операторами машинного доения ветеринарно-санитарных правил доения коров, при неправильном запуске, несоблюдении курса лечения маститных животных.

При скрытом мастите происходит расстройство функции молочной железы, клинически проявляющееся гипогалактией и изменением биохимических свойств молока. Объективным показателем здорового вымени у коровы является количество содержащихся соматических клеток в молоке. Соматические клетки молока являются нормальным компонентом в качественном молоке. Соматические клетки в молоке коровы представлены лейкоцитами и эпителием альвеол и молоко выводящих путей молочной железы. Если в секрете молока от здоровой коровы преобладают эпителиальные клетки, которые образуются в тканях вымени в процессе естественного старения и обновления тканей, то при мастите происходит усиление миграции лейкоцитов в очаг воспаления, что в конечном итоге приводит к резкому возрастанию соматических клеток в молоке. Если в 1мл молока от клинически здоровых коров содержится в среднем 250тысяч соматических клеток, то при заболевании маститом их количество возрастает до 950тысяч. Молоко от коров больных субклиническим маститом имеет пониженную кислотность (до 8-12 градусов по Тернеру, реакция молока становится слабощелочной, происходит увеличение содержания хлоридов, альбуминов и глобулинов, в несколько раз увеличивается количество клеточных элементов, особенно лейкоцитов. Одновременно происходит уменьшение содержания сухих веществ (казеина, лактозы, кальция и фосфора).

При попадании молока от коров больных скрытой формой мастита в общий удой делает его непригодным для приготовления сыров, молочнокислой продукции и крайне отрицательно сказывается на здоровье человека.

Скрытые маститы могут быть причиной в дальнейшем клинически выраженных маститов, но в основной своей массе остаются незамеченными доярками, и ветспециалистам до очередной проверки дойного стада на скрытую форму мастита, постепенно приводя корову к гипогалактие, агалактие в связи с гибелью части клеток секреторного эпителия молочной железы и регенерации за счет соединительной ткани и даже атрофии пораженной доли вымени. При проведении глубокой пальпации в пораженной четверти в отдельных случаях ветспециалист может обнаружить отдельные очаговые уплотнения тканей вымени, сужение емкости цистерны и соскового канала, утолщение стенок соска.

Диагностика. Экспресс — диагностика субклинического мастита в лактационный период основана на определении количества соматических клеток в молоке, а также посредством оценки реакции диагностических реактивов (2% раствор мастидина, 5% раствор димастина, мастоприма, 2% раствор мастотеста, с калифорниским тестом, кено тестом) с пробой молока. Проведение реакции с диагностическим реактивом осуществляется с использованием молочно-контрольной пластинки (МКП-1 или МКП-2). Для этой цели из каждой доли молочной железы выдаиваем в соответствующие лунки МКП по 1мл молока, затем добавляем по 1мл одного из одного вышеуказанных реактивов при помощи стеклянной палочки смешиваем их. Учет реакции проводим в течение 15-20сек по образованию желеобразного сгустка или изменению цвета смеси.

При наличии воспалительного процесса, в молочной железе образуется хорошо сформированный желеобразный сгусток (от умеренного до плотного), при этом сгусток хорошо выбрасывается палочкой из луночки пластинки при перемешивании.

Экспресс-диагностику субклинического мастита с целью исключения раздражения вымени, представляющую собой кратковременную реакцию молочной железы, возникающую в ответ на нарушение технологии машинного доения, воздействие ряда неблагоприятных факторов внешней среды проводим дважды с 48-часовым интервалом, когда после устранения вышеуказанных неблагоприятных факторов в течении 48часов молочная железа приходит в норму. При этом больными маститами считаем тех коров, которые дважды дают положительную реакцию с одним из диагностик умов.

Дополнительным методом исследования на мастит служит проба отстаивания, положительный результат которой говорит о скрытой форме мастита. Для выполнения данной пробы специалист берет в пробирки 10-15мл молока из тех долей вымени, которые дали положительные реакции с маститными тестами и ставит данные пробирки в штативе на 16-18 часов в холодильник или другое холодное место где имеется температура 4-10градусов. Учет реакции проводим путем просмотра пробирок с молоком при дневном освещении.Молоко из здоровых долей имеет белый или слегка синеватый цвет, а осадок отсутствует. Молоко из долей больных скрытым маститом дает образование на дне пробирки осадка, при этом слой сливок уменьшается, они становятся тягучими, слизистыми, хлопьевидными.

В сухостойный период и во время запуска диагностика основана на проведение клинического обследования молочной железы, органолептической оценке секрета, определении в молоке и секрете количества соматических клеток, оценке реакции с одним из вышеуказанных диагностических реактивов, постановке пробы отстаивания.

Всех коров в последний день запуска ветспециалист хозяйства или госветслужбы обследует клинически. При отсутствии клинических признаков мастита (увеличение доли, болезненности, уплотнения тканей, изменение секрета и повышение местной температуры), ветспециалист проводит исследования секрета из каждой четверти вымени по одному из вышеуказанных быстрых маститных тестов и ставит пробу отстаивания.

В сухостойный период обследование молочной железы проводят дважды: через 10-15дней после запуска коровы и за 10-15дней до ожидаемого отела. При выявлении больных скрытой формой мастита проводим лечение.

В последние годы, учитывая, что работа по исследованию дойного стада на скрытую форму мастита очень трудоемка, а также запросы специалистов с мест с целью облегчения работы ветспециалистам в сельскохозяйственных предприятиях по диагностике скрытых форм мастита ученые предложили использовать электронные методы выявления субклинических маститов. Данные методы основаны на том, что при маститах происходит повышение содержания уровня ионов хлора в молоке, которые в свою очередь вызывают снижение электрического сопротивления молока. Мы Ветспециалисты Гороховецкой ветстанции, чтобы подтвердить эффективность и достоверность получаемых данных при исследовании дойного стада на скрытую форму мастита провели тестирование данного прибора «Маститон» в сельскохозяйственном предприятие ООО» Лукьяново».

Для исследования на скрытую форму мастита во время проведения контрольной дойки брали от 15 до 20мл молока из каждой четверти функционирующих долей вымени. Для этого в прибор после подмывания дояркой вымени сдаивали первые порции молока непосредственно в чашку прибора так, чтобы электроды прибора были полностью закрыты молоком. После этого нажимали кнопку включения, удерживая ее в нажатом состоянии 1-2секунды, до установления показателей на дисплее ЖКИ. Записав показатели прибора в специально заведенном журнале исследования дойного стада на скрытую форму мастита, с указанием инвентарного номера исследуемой коровы, приступаем к исследованию других долей вымени.

Прибор «Маститон» имеет достаточно широкий диапазон данных на ЖКИ дисплее (от 000 до 1999 единиц), позволяя практическим ветспециалистам достаточно точно интерпретировать результаты исследования на мастит:

при показаниях на дисплее значений 450 единиц и ниже — данный образец молока из исследуемой доли вымени, говорит о том, что молоко высокого качества; а вероятность субклинического мастита крайне низка.
при показаниях 450- 600 единиц говорит нам о том, что в исследуемой доле существует вероятность возникновения скрытой формы мастита.
при показаниях на дисплее выше 600 единиц говорит о наличии в данной доле вымени скрытой формы мастита и чем выше показатели на дисплее, тем большая вероятность существует у данной коровы перехода субклинического мастита в клиническую форму.

Учитывая, что при однократном исследовании нельзя определить по каждой корове какое-либо фиксированное число, по которому бы ветспециалист мог однозначно определить наличие или отсутствие у данной коровы субклинического мастита, мы вынуждены будем провести многократные исследования в динамике. И по каждому конкретному случаю проследить наличие увеличения или уменьшения показателей на дисплее. По каждому проведенному исследованию его результаты записываем в карточку конкретной коровы.

Чтобы определить границы «здоровое молоко-субклинический мастит» при показаниях прибора около 600 единиц проводили пробу с кено тестом, которая давала положительную реакцию на скрытый мастит. В результате проводимых исследований при помощи прибора «Маститон» в результате повышения уровня ионов хлора в молоке показала нам возможность выявить тенденцию возникновения скрытого мастита еще до того как проба с кено тестом будет давать положительную реакцию на мастит.

Прибор не дает однозначной цифры, выше значений которой специалист должен приступать к лечению коровы. К расшифровке результатов обследования каждого животного следует подходить строго индивидуально т.к. небольшие отклонения от приведенных выше показателей не обязательно свидетельствуют о наличие у коровы мастита. На показатели прибора оказывают влияние- жирность молока, рацион кормления коровы, условия содержания. К примеру у коровы имеющей наибольшую жирность молока в отличие от других коров показатель на дисплее будет выше среднего чем по стаду. У коров 9- летнего возраста и старше в молоке физиологически увеличивается содержание натрия хлорида и количество соматических клеток. В результате чего имеем завышенные показания прибора. У таких коров очень важно обследовать молоко из всех 4-х долей и если три доли дают показание на дисплее прибора 450 единиц, а одна-590, то данный показатель говорит нам о риске заболевания маститом в доле с наибольшим показателем.

С целью выявления субклинического мастита и наблюдения за здоровьем вымени ветспециалистам необходимо вести наблюдения за динамикой изменений показателей электропроводности молока по дисплею ЖКИ прибора «Маститон» у каждой коровы.

Например, у дойной коровы с инв.№1183 при проведении контрольных доек показатели на дисплее по трем четвертям вымени идут в диапазоне 450-550 единиц, а в четвертой доле 600 единиц, то данный показатель будет говорить нам о наличии скрытого мастита в данной доле, а для коров имеющих обычно показатели в интервале от 400 до 500 единиц, получение результата на дисплее 550 и более единиц будет служить показателем о появлении скрытого мастита.

Если при исследовании дойного стада на скрытую форму мастита мы получим показатели 600 единиц и более, то мы должны будем у данного животного перейти к регулярным исследованиям вымени на скрытую форму мастита т.к. данные показатели нам говорят о наличии у коровы мастита или механической травмы вымени.

Отдельные коровы переболевшие маститом, могут длительное время показывать результаты на дисплее 500 единиц и более даже после полного клинического выздоровления, т.к. это связано с последствиями воспаления молочной железы.

Полученные с помощью прибора Маститон данные позволяют практическим ветврачам, да и фермерам своевременно отбирать больных животных из стада, проводить их углубленное обследование на мастит и при его наличие назначать соответствующее лечение.

Если во время контрольной дойки мы выявим большое количество коров показывающих результат 500 единиц и выше, то специалистам хозяйства необходимо провести анализ заболеваемости коров маститами (смотри статью анализ заболеваемости коров маститами в сельскохозяйственном предприятии).

Лечение. Больную субклиническим маститом корову переводим с машинного доения на ручное.

При проведении ручного доения делаем массаж вымени. Применяем методы физиотерапии (аппликации на вымя озокерита, парафина, согревающие повязки (навымник), компрессы, прогревание лампами солюкс, инфраруж и др.).

Проводим лечение с использованием лазерных аппаратов различных модификаций. При использовании лазерного аппарата «СТП» и «ЛАПА» продолжительность одного сеанса в минутах для «СТП»-4-5минут, для «ЛАПЫ»-1минута, курс лечения состоит из 3-4 сеансов по 1 сеансу в день.

Внутримышечно вводим антибиотики: тилозин 200 один раз в день по 8-10мл-3дня. Билозин 200 (инъекционный раствор макролидного антибиотика тилозина в форме основания), в 1мл содержится 200мг тилозина основания (20%). Применяем в дозе 0,5мл на 10кг массы тела животного 2 раза в день (молоко нельзя использовать для пищевых целей в течении 7дней).

Эфикур из расчета 1мл на 50кг массы тела животного подкожно в течении 2-3дней. Можно применять традиционные антибиотики, предварительно проверив молоко из пораженной четверти вымени на чувствительность к антибиотикам.

Внутривымянно применяем Мастиет-форте 10мл в пластмассовом шприце.

Неплохие результаты получают от внутривымянного введения 150 мл парного высоколизоцимного молока (полученного от здоровых коров) 1-2 раза в день в течении 2-3дней.

Рекомендуются блокады вымени с использованием раствора новокаина и тримекаина.

Профилактика. В сухостойный период — проводим запуск коров за 1,5-2 месяца до предполагаемого отела. Запуск начинаем с ограничения дачи сочных кормов и концентратов до 50% рациона. Коров с трехкратного доения переводим на двукратное, затем на однократное, после этого корову начинаем доить через день и прекращаем совсем. У высокопродуктивных коров, которые обычно трудно запускаются, иногда приходится из рациона исключать полностью сочные и концентрированные корма и ограничивать водопой.

Ввиду того, что заболевание коров субклиническим маститом очень часто встречается в период запуска и сухостоя владельцы животных и специалисты хозяйств должны усилить контроль за состоянием вымени в эти периоды. Специалисты должны один раз в две недели проводить клиническое обследование вымени с пробным сдаиванием секрета из молочных четвертей.

В ряде хозяйств Ветспециалисты с целью профилактики послеродовых маститов при запуске коров применяют внутривымянное введение антибактериальных препаратов. Причем обычно вводят препараты длительного спектра действия (бициллин-3 в дозе 300тыс ЕД в каждую запускаемую четверть, Мастикур, мастицид,Мастиен- форте, Мамифорт Секадо по одному шприцу содержащему 10мл. препарата в каждую четверть вымени, а также другие антибактериальные средства).

источник

Лабораторная диагностика мастита основана на выявлении физико-химических, биологических изменений секрета, увеличения в нем количества соматических клеток (лейкоциты, эпителиальные клетки выводных протоков) и выделении возбудителя.

Косвенно соматические клетки определяют с помощью диагностических реактивов беломастина, мастидина, димастина, мастоприма, пробы Уайтсайда, содержащих поверхностно-активные вещества (ПАВ). ПАВ разрушают мембраны клеток, высвобождают из ядер ДНК и вступают с ней в реакцию, образуя желе. По степени образования желеобразного сгустка косвенно судят о количестве соматических клеток в молоке. Реакцию молока с диагностическим реактивом проводят на молочно-контрольных пластинках ПМК-1 или ПМК-2, имеющих 4 луночки, соответственно долям вымени коровы. Определение соматических клеток с помощью диагностических реактивов проводят в молоке из отдельных долей вымени или удоя коровы.

После каждого исследования необходимо промывать молочно-контрольные пластинки.

Проба с беломастином. Реакция основана на способности поверхностно-активного вещества образовывать гель с молоком, содержащим соматические клетки. При исследовании молока (секрета) из вымени коров, диагностикум разводят дистиллированной или кипяченой водой в соотношении 1: 3 (к 100 мл беломастина добавляют 300 мл воды). Срок использования рабочего раствора 8 месяцев.

Для проведения пробы с беломастином в луночки молочно-контрольной пластинки (МКП-1) из соответствующих долей вымени выдаивают по 1 мл испытуемого молока и добавляют 1 мл рабочего раствора диагностикума с помощью пипетки. Смесь молока с реактивом перемешивают стеклянной палочкой в течении 9-10 секунд. Результаты реакции:

· отрицательная реакция (-) — жидкая смесь остаётся однородной;
· сомнительная реакция (-, +) — в смеси образуются слизистые нити;
· положительная реакция (+) — смесь приобретает консистенцию слизистой массы или желеобразного сгустка.

Для контроля результатов лечения больных маститами животных молоко исследуют на 10-14 день после введения препаратов. В сборном молоке при отрицательной реакции в 1 мл содержится до 500 тыс. соматических клеток, при сомнительной — от 500 тыс. до 1 млн; при положительной — свыше 1 млн.

Проба с 2% раствором мастидина. Для приготовления 2% раствора мастидина к 100 мл 10% раствора, выпускаемого отечественной промышленностью, прибавляют 400 мл дистиллированной или прокипяченной воды. В луночки молочно-контрольной пластинки (ПМК-1, ПМК-2) из соответствующих долей вымени надаивают по 1 мл молока и добавляют 1 мл приготовленного 2% раствора мастидина с помощью пипетки-автомата или дозатора жидкости. Смесь молока с реактивом перемешивают палочкой в каждой луночке ПМК-1 поочередно в течение 10-15 секунд. При использовании ПМК-2 смешивание молока с реактивом проводят одновременно во всех луночках, путем ротационного вращения пластинки в горизонтальной плоскости. Реакцию учитывают по густоте желе:

· отрицательная реакция (-) — однородная жидкость;
· сомнительная реакция (-, +) — следы образования желе;
· положительная реакция (+) — ясно видимый сгусток, который можно выбросить из луночки палочкой при перемешивании.

На пластинке ПМК-2 при отрицательной реакции:

· (-) — образуется однородная смесь;
· (-,+) — при сомнительной реакции во время вращения пластинки на дне луночки заметны тонкие нити (тяжи) без тенденции образования сгустка;
· (+) — положительная реакция отчетливое появление слабого или быстро образующегося плотного сгустка, концентрирующегося при вращении пластинки в центре луночки.

Определение рН молока по цвету с 2% раствором мастидина:

· светло-сиреневый, дымчатый — рН молока нормальная (рН = 6,5-6,8);
· почти белый — повышенная кислотность молока (рН меньше 6,5);
· темно-сиреневый — повышенная щелочность молока (рН больше 8).

Проба с 5% раствором мастидина. Раствор мастидина готовят на дистиллированной или прокипяченной теплой воде.Постановку пробы и учет реакции желеобразования проводят как при исследовании молока с 2% раствором мастидина.

Определения рН молока по цвету:

· оранжевый, оранжево-красный (красно-оранжевый) — нормальная реакция молока (рН = 6,5-6,8);
· желтый — повышенная кислотность молока (рН меньше 6,5);
· красный — повышенная щелочность молока (рН больше 6,8);
· алый и малиновый — ярко выраженная щелочность молока (рН больше 7.0).

Проба с 1% раствором мастоприма. Препарат мастоприм представляет собой порошок желтоватого цвета, состоящий из смеси сульфанола (4 части) с едким натрием (1 часть). Раствор мастоприма готовят на дистиллированной воде.

Постановку пробы и учет реакции желеобразования проводят как при исследовании молока с 2% раствором мастидина.

Проба с димастином (по В.И. Мутовину.) Димастин включает в себя 2 реагента: поверхностно активное вещество акрилсульфонат и индикатор бромкрезол пурпур.

Проба позволяет одновременно выявлять в молоке щелочную реакцию и повышенное содержание клеток. Для этого в лунку молочно-контрольной пластинки вносят пипеткой по 1 мл исследуемого молока. Добавьте к нему из склянки 1 мл 5% раствора димастина. Стеклянной палочкой смешивают0 молоко с реагентом и сравните показания реакции. Молоко из больной четверти приобретает малиновый цвет и образует желеобразный сгусток. Молоко из здоровой доли — оранжевый цвет, а его консистенция не изменяется.

Проба Уайтсайда. Проба основана на косвенном учете повышенного содержание лейкоцитов и эпителиальных клеток. В лунку молочно-контрольной пластинки вносят глазной пипеткой 5 капель молока и добавляют 2-3 капли 4% водного раствора едкого натра. Реактивную смесь перемешивают стеклянной палочкой 20-30 сек. Молоко из больной доли вымени дает образование желеобразного сгустка.

Проба с розоловой кислотой. В лунку молочно-контрольной пластинки вносят 10 мл молока и добавить 1 мл 0,1% раствора розоловой кислоты на 65% спирте. В норме содержимое приобретает светло-розовую окраску. При патологии окраска содержимого имеет цвет от светлого до темно-красного.

Проба с мастит-диагностом. В состав мастит-диагноста входит: вода 100 мл, сульфанол-30, тринолинфосфат-5г, бромтимоловый синий — 0,02г, 1% раствор розоловой кислоты-0,5 мл.

В лунки молочно-контрольной пластинки вносят 1 мл молока и 1 мл реактива и смешивают. Гомогенная смесь — молоко от здоровых коров; наличие плотного желеобразного сгустка, тягучей массы или редко слизи — положительная реакция на скрытый мастит.

Бромтимоловая проба по Эрасту. Реактив: 0,1 г бромтимолблау + 100 мл 960 спирта. Берут 5 мл молока и добавляют 1 мл реактива, встряхивают в пробирке. При норме цвет желтоватый, желтый, желто-салатовый, желто-зеленый. Патология — светло-зеленый, зеленый, ярко-зеленый, сине-зеленый и синий цвет

Бромтимоловая проба по Логвинову. Реактив: 0,1 г бромтимолового индикатора + 20 мл 960 спирта + 80 мл дистиллированной воды. Берем 1 мл молока и 1 мл бромтимоловой пробы в луночки прибора для определения качества молока. Если появляется синяя окраска смеси, то реакция положительная. Если желтоватый цвет или без изменений, то реакция отрицательная.

Проба с бензидином. Используется для выявления в молоке пигментов крови. В пробирку наливают 5 мл 3% -ного раствора перекиси водорода и 2 мл насыщенного раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте. После тщательного взбалтывания в смесь прибавляют 2-10 капель молока. Положительная реакция — смесь окрашивается сначала в зеленый, а через минуту в темно-синий цвет; отрицательная — смесь светлая с беловатым хлопьевидным осадком.

Проба отстаивания. Молоко из каждой четверти вымени положительно реагирующее, проверяют пробой отстаивания. При положительной пробе, корова считается больной маститом. В конце доения из каждой доли в пробирку берут 10-15 мл молока и ставят на 16-18 часов в холодное место (в холодильник, при температуре от +4 до 100С), чтобы молоко не прокисло. Реакцию читают на второй день у источника света. Исследуют: цвет молока, наличие осадка, толщину и характер слоя сливок. Молоко от здоровой коровы белого или слегка синеватого цвета, осадок не образуется. Молоко от больной коровы — водянистое, консистенция сливок изменена (тягучие, слизистые, хлопьевидные). Главный признак — наличие осадка высотой 1 мм и более. Слой сливок толщиной более 1,5 см — нет мастита, слой менее 5 мм — есть мастит.

Коров с отрицательным результатом при постановке пробы отстаивания проверяют повторно при помощи вышеуказанных диагностических тестов не позднее чем через 6 дней после первой проверки.

источник

Для профилактики маститов и предупреждения получения молока низкого качества необходимо своевременно проводить диагностические исследования.

Как отмечено выше, по клиническим признакам маститы у коров подразделяют на серозный, катаральный, фиброзный, гнойный и геморрагический. Показатели дифференциальной диагностики клинически выраженного мастита представлены в таблице 5.

Субклинический мастит диагностируют путем исследования молока с одним из быстрых диагностических тестов (БМТ), используя при этом пробу молока с димастином, мастидином, мастотестом Воронежским, или с помощью анализатора Экотест-303 и маститоизмерителя фирмы «Драмински». Действие быстрых маститных тестов основано на выявлении увеличенного количества лейкоцитов и изменения рН молока.

Более эффективно исследовать цистернальное (первые порции) и паренхимное (последние порции) молоко. Исследования проводят обычно на молочно-контрольных пластинах (МКП-1 или МКП-2), которые имеют по четыре (числу четвертей вымени) лунки с углублением, объемом 1 мл или 2,5 мл.

5. Дифференциальная диагностика клинически выраженного мастита у коров

Секрет пораженной четверти

Часто, без изменений, реже легкое угнетение, температура тела

Кожа напряжена, непигментиро-ванные участки гиперемированы,

Поражены чаще половина или

оно увеличено, неравномерно уплотнено, часто сосок местами

Вначале внешне не изменен,

Без видимых изменений, иногда легкое угнетение, аппетит понижен, температура тела повышена

болезненность слабо выражена или отсутствует

она увеличена или местами

уплотнена, особенно у основания;

у основания очаги флюктуации

Жидкий, водянистый, серовато-белого цвета

с примесью желтоватых или беловатых хлопьев, реже выделяется небольшое количество желтоватой сыворотки с хлопьями или густая сметано-образная масса

Угнетенное, аппетит понижен или отсутствует, температура тела повышена, хромота, исхудание

Кожа напряжена, непигментированные участки гиперемированы,

четверть вымени болезненна

она резко увеличена, уплотнена с наличием отдельных

размягчения, сосок отечный, иногда отмечают крепитацию

реже густой экссудат с преобладанием хлопьев,

могут быть примеси крови, сгустки

Угнетение, отказ от корма, температура тела повышена, хромота

Кожа напряжена, непигментированные участки

гиперемированы, температура кожи повышена, болезненность выражена

Пораженная четверть вымени увеличена, местами

чаще густой с хлопьями белого или желтого цвета, может быть жидким, желто-красного цвета

напряжена, отечна, гиперемирована,

неравномерно увеличена, прощупываются флюктуирующие, напряженные очаги разной величины;

при глубоком расположении абсцессов четверть

увеличена, флюктуация слабо выражена

Вначале молоко не изменено,

но его мало; затем оно становится водянистым, серовато-белого цвета с примесью гноя, казеина; вид секрета зависит от количества абсцессов и места их вскрытия (через кожу или просвет молочных ходов)

Сильно угнетенное, температура тела значительно повышена, аппетит пони-жен или отсутствует, хромота

Кожа напряжена, отечна, равномерно гиперемирована, температура высокая, болезненность значительная

Пораженная четверть значительно увеличена; сильно отечный сосок

Секрета мало, он водянистый, сероватого цвета с примесью хлопьев, нередко кровянистый

Угнетенное, температура тела значительно повышена, аппетит понижен

Кожа отечна, равномерно гиперемирована, температура повышена, болезненность значительная

Чаще поражены половина или

все вымя; пораженная часть равномерно увеличена и уплотнена;

водянистый, красноватого цвета,

с хлопьями и сгустками крови

Методы выявления маститов у коров можно разделить на следующие группы:

Физико-химические методы диагностики мастита. Используются как вспомогательные наряду с другими тестами. К ним относятся индикаторные методы, каталазная проба, определение хлорсахарного числа, плотности и электропроводимости молока, а также опсонофагоцитарная реакция лейкоцитов молока.

Индикаторные методы чаще используют при определении рН молока. Они основаны на изменении цвета индикатора при тех или иных изменениях рН молока. Наиболее чувствительными являются: бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, феноловый красный, нейтральный красный, крезоловый и другие. Молоко здоровых коров имеет слабокислую реакцию (рН 6,3-6,9). При заболевании коров маститом реакция молока в большинстве случаев становится щелочной (рН 7,0 и выше) и очень редко кислой (рН 6,0 и ниже). Кислая реакция молока также бывает после отела, а щелочная — у стародойных и у коров, находящихся в запуске.

Для контроля за состоянием молочной железы руководствуются «Методическими указаниями по диагностике, лечению и профилактике маститов у коров».

Для диагностики скрыто протекающих маститов используют 10%-ный раствор мастидина или 10%-ный раствор мастотеста Воронежского, или 20%-ный раствор сульфанола (который перед анализом разводят водой до 10%-ной концентрации), или 5%-ный раствор димастина, мастоприма или 4%-ный раствор гидроокиси натрия (проба Уатсайда), а также пробу отстаивания.

Все диагностикумы содержат поверхностно-активные вещества, которые, взаимодействуя с лейкоцитами, образуют сгусток, а индикатор изменяет цвет в зависимости от реакции среды (рН).

Проба с димастином является одним из широко применяемых методов исследования молока с целью выявления субклинического мастита.

Для диагностики заболевания необходимы пластинки с углублениями, пипетки на 1 мл, стеклянная палочка, 5%-ный раствор димастина (приготовленный на дистиллированной воде), автомат-пипетка на 1 мл.

При исследовании в луночки пластинки от каждой доли вымени наливают по 1 мл молока последней порции удоя, добавляют по 1 мл 5%-ного раствора димастина. Содержимое луночки перемешивают стеклянной палочкой. Молоко, полученное от коров, больных маститом, образует плотный тягучий сгусток ярко-красного цвета. Если образуется сгусток желеподобной консистенции красного цвета, то считают, что молоко получено от коров, подозрительных по заболеванию маститом. Нормальное молоко остается однородным, цвет его оранжево-красный.

Проба с мастидином. Пробу проводят так же, как с димастином.

Реакцию учитывают главным образом по густоте желе. Положительная реакция — сгусток похож на белок куриного яйца, фиолетового или

темно-сиреневого цвета, отрицательная — однородная жидкость или слабый сгусток светло-сиреневого или дымчатого цвета. В таком же порядке исследуют молоко другими диагностиками (мастограм, сульфанол).

Проба с отстаиванием. В пробирку наливают 10-15 мл молока, отстаивают в течение 16-18 ч на холоде и на второй день учитывают реакцию. В молоке коров, больных маститом, на дне пробирки образуется осадок с желтоватым или синеватым оттенком высотой 0,1 см и более, а также уменьшается слой сливок. Молоко от здоровых коров осадка не образует. Если проба с отстаиваиванием дает сомнительные результаты, то для уточнения диагноза, молоко направляют на исследование в ветеринарную лабораторию, где определяют число лейкоцитов, активность каталазы и лизоцима, исследуют бактериологически.

Каталазная проба. Каталаза содержится в молоке здоровых коров в небольшом количестве, при воспалительных процессах ее содержание увеличивается. Данная проба основана на определении в молоке увеличенного содержания фермента каталазы, которая продуцируется клетками тканей, соматическими клетками, а также некоторыми микроорганизмами. Наибольшее количество каталазы вырабатывают лейкоциты. Проба основана на принципе расщепления каталазой перекиси водорода с выделением газообразного кислорода. Ставят ее в специальных каталазных или градуированных пробирках. Известны и более упрощенные, ускоренные модификации пробы в виде смешивания молока и раствора перекиси водорода в углубленной черной пластинке или обычных пробирках, где в положительных случаях сразу после перемешивания появляется пенообразование.

Заслуживает внимания очень простой метод каталазной пробы путем погружения в раствор перекиси водорода бумажных дисков, смоченных исследуемым молоком. По времени обнаружения диска на поверхности смеси судят об активности каталазы или о количестве соматических клеток в молоке. Каталазная проба является чувствительным тестом, хотя в ряде случаев, обнаруживается положительная реакция с молоком здоровых коров.

Определение хлорсахарного числа. Хлоросахарное число — это соотношение хлоридов и лактозы (молочного сахара). В нормальном молоке в середине лактации содержится около 0,07% хлоридов и 4,5-4,7% лактозы. Наиболее приемлемым показателем является число Кестлера (процент хлоридов, умноженный на 100 и деленный на процент лактозы). Для нормального молока это число составляет 2 или меньше, а для анормального молока превышает 3.

Лактоза и хлориды имеют важное значение в регулировании осмотического давления молока. Данный показатель является величиной постоянной и характеризует состояние физиологических процессов в организме. Уровень осмотического давления молока зависит от количества растворимых в нем молочного сахара и хлористых солей.

При воспалительных процессах вымени вследствие нарушения секреции в молоке значительно уменьшается количество лактозы, которая не поступает в готовом виде из крови, а синтезируется в молочной железе.

В результате снижается осмотическое давление молока. Так как молоко и кровь изотоничны, то для выравнивания осмотического давления из крови в молоко усиленно начинают диффундировать соли, главным образом — хлористый натрий. Содержание лактозы в молоке при воспалительных процессах в молочной железе является первичным, а солей — вторичным. Границы содержания хлоридов в нормальном молоке — 0,05-0,12%, а в анормальном (при мастите) — 0,30% и более. Содержание лактозы в молоке при ранней форме мастита всегда ниже нормы (в среднем 1,5%).

Массовую долю лактозы можно определить с помощью препарата ЛУМ. Он представляет собой порошкообразную смесь, в состав которой входит лимоннокислый натрий (50%), углекислый натрий безводный (25%) и сернокислая медь (25%). Перед исследованием готовят 4%-ный раствор препарата ЛУМ на дистиллированной воде. Раствор имеет синее окрашивание. В пробирки наливают по 2 мл раствора, добавляют по 2 капли исследуемого молока, перемешивают и ставят в кипящую водяную баню на две минуты. По истечении этого времени пробирки вынимают и учитывают результаты по цвету жидкости. Для сравнения цвета оставляют одну контрольную пробирку. Если цвет реактива с молоком после выдерживания в водяной бане остается синим, молоко содержит в среднем 3% лактозы, при темно-зеленом (сине-зеленом) цвете — 3,45%, при зеленом — 4,4%, а при желто-зеленом или салатном цвете — выше 5%.

Определение плотности молока проводят спустя 2 ч после дойки при температуре 20-25°С. Для этого молоко сначала перемешивают, а затем наливают в стеклянный цилиндр и при помощи ареометра, который погружают в цилиндр, определяют плотность. Нижней границей нормы принята величина 1,027 г./см 3 . При заболевании коров маститом плотность молока обычно снижается.

Опсоно-фагоцитарная реакция лейкоцитов молока (ОФР) отражает состояние организма животного, ее используют для уточнения диагноза ранней формы мастита. Для постановки реакции готовят взвесь суточной культуры, содержащую 1 млрд. сапрофитного стафилококка (подогретую до 80°С в течение 30 мин), 0,5 мл взвеси антигена смешивают с 0,5 мл исследуемого молока. Смесь инкубируют в термостате в течение 30 мин, затем делают мазки, высушивают их и окрашивают по Романовскому-Гимза 10 мин. Подсчитывают 50 лейкоцитов и количество находящихся в них бактерий. Учитывают результат по количественному показателю фагоцитоза (АФ) и качественному показателю (ИФ). АФ равен количеству участвующих в фагоцитозе лейкоцитов, деленному на число подсчитанных лейкоцитов и умноженному на 100. ИФ равен количеству поглощенных бактерий, деленному на количество лейкоцитов. Оценка показателей ОФР производится по полученным результатам: при низком уровне фагоцитоза ИФ не превышает 1,0, АФ — 52,0; при среднем ИФ — 1,0-1,5, АФ — 52,0-62,0; при высоком уровне ИФ — 1,5-2,4; АФ — 62,0-79,8.

Для диагностики маститов во многих странах мира (Япония, Голландия, Германия, Англия, Швеция) применяется приборный метод, основанный на изменении электропроводимости молока. Известно, что электропроводимость молока связана с содержанием в нем ионов натрия, калия, хлора и других химических элементов. Японская фирма «Искра» разработала систему автоматического детектирования мастита «Чекгейт». Данный детектор устанавливают перед дойкой в доильный аппарат; вторую часть системы (приборный блок со световой индикацией) помещают на видном для мастера машинного доения месте. Индикаторные лампочки загораются в случае, если имеются соответствующие изменения в составе молока; другие две лампочки сообщают об окончании выделения молока по четвертям.

Цитологические методы диагностики мастита. Методы основаны на определении количества соматических клеток в молоке. Они делятся на прямые и непрямые.

В состав соматических клеток входят лейкоциты (80-85%), эритроциты, клетки плоского, цилиндрического и кубического эпителия молочной железы, колостральные тельца (15-20%). В 1939 году Уайтсайд заметил, что при добавлении к молоку коровы, больной маститом, едкого натра, после помешивания образуется густая тягучая масса. Открытие послужило основанием к использованию поверхностно-активных веществ для косвенного определения количества соматических клеток в молоке.

Проба Тромсдорфа. Один из давно известных методов обнаружения повышенного количества соматических клеток в молоке. Сущность ее заключается в осаждении повышенного содержания лейкоцитов и других клеточных элементов при центрифугировании 10 мл молока, после чего по объему осадка судят о наличии или отсутствии заболевания.

Проба Уайтсайда основана на смешивании 4%-ного раствора едкого натра с молоком в соотношении 1:5. При наличии воспалительных процессов в вымени образуется тягучая густая масса с хлопьями.

В настоящее время широко применяются быстрые маститные тесты из поверхностно-активных веществ, которые отражают количество соматических клеток в молоке. Действующим началом являются поверхностно-активные вещества типа алкиларилсульфатов и алкиларилсульфонатов. За рубежом предложен целый ряд таких реактивов: мичиганский маститный тест, бернбург, стара загора, софия и другие.

В нашей стране используются следующие препараты: димастин, мастидин, маститодиагност, универсал. Желеобразный сгусток образуется в результате разрушения поверхностно-активными веществами ядер клеток, содержащихся в молоке. Переходящая при этом в раствор нативная дезоксирибонуклеиновая кислота придает ему вязкость. Учет результатов проб проводится по характеру образования желеобразного сгустка.

Прямой подсчет соматических клеток считается наиболее точным показателем диагностики мастита. Международная молочная федерация приняла решение считать нормальным наличие в 1 мл сборного молока до 500 тыс. соматических клеток.

Метод Прескотта и Бритта считается арбитражным в международном масштабе, он является контрольным при автоматическом подсчете соматических клеток в молоке. Он основан на свойстве ядер соматических клеток ярко окрашиваться специфическими красителями. После окрашивания (по Романовкому-Гимза) и высушивания мазок молока микроскопируют под иммерсионным объективом. В каждом мазке просматривают 100 полей зрения. Подсчитывают число клеток, умножают его на коэффициент для пересчета с учетом объектива и окуляра и определяют количество клеток в 1 мл молока.

Камерный метод заключается в подсчете соматических клеток в камере Горяева. Сначала необходимо растворить жировые шарики этиловым спиртом или формалином, синтанолом ДС-10 и покрасить пробу, затем под микроскопом подсчитывают количество соматических клеток во всей камере.

Расчет числа клеток проводят по формуле:

где Х — количество соматических клеток в 1 мл молока; 1000 — множитель, приводящий результат к объему 1 мл; 50 — разведение молока; а — сумма клеток в определенном объеме камеры; V — объем камеры.

Подсчет клеток с помощью прибора Культера. Данный прибор представляет собой электронный счетчик с капиллярной трубкой диаметром 100 мкм, подсчитывающий объем молока 0,1 или 0,5 мл (модель F, FN). Сначала проводят калибровку согласно инструкции изготовителя с применением стандартной суспензии частиц. Калибровку проводят по нескольким образцам молока, содержащего от 300 тыс. до 1 млн. клеток в 1 мл, что предварительно определяется под микроскопом. Модельный диаметр соматических клеток должен находиться между 5,45 и 6,25 мкм (рабочий режим счетчика). Реактив для подсчета соматических клеток, в состав которого входят вещества, способствующие растворению жировых шариков (синтанол ДС-10) и делающие раствор электролитичным (хлористый натрий), пропускают через стеклянный фильтр. Подсчет клеток в смеси молока с эмульгирующим электролитом проводят в пределах одного часа при температуре 15-25°С.

Во время подсчета электрод, погружающийся в трубку измерительного прибора, должен находиться ниже поверхности жидкости.

К 9,9 мл синтанола добавляют 0,1 мл фиксированного формалином молока. Образец подогревают при 80°С в течение 10 мин в водяной бане и охлаждают. После этого под трубку подводят стаканчик с 10 мл приготовленного молока. Включают прибор, предварительно поставив его на соответствующий рабочий режим. Результаты подсчета видны на табло (соматических клеток, тыс. на 1 мл молока).

Подсчет соматических клеток на приборе Фоссоматик. Метод основан на образовании флуоресцентного комплекса при взаимодействии люминесцентного красителя с ДНК ядра клетки, поэтому он является специфическим, так как подсчитываются только клетки, имеющие в своей структуре ядро. Фоссоматик — электронный прибор, предназначенный для подсчета соматических клеток в сыром и консервированном молоке.

Бактериологические методы диагностики мастита. Для бактериологического анализа молока на мастит с соблюдением правил асептики отбирают пробы из четвертей вымени, подозреваемых в заболевании. Для посева применяют обычные или элективные питательные среды. Чаще всего используется кровяной мясо-пептонный агар.

Для идентификации выросших культур изучают их свойства. Крупные выпуклые колонии, вне зависимости от наличия зоны гемолиза, ориентировочно относят к стафилококкам; мелкие росинчатые — к стрептококкам; серые и круглые колонии (блестящие и плоские) обычно указывают на рост бактерий группы кишечных палочек. Появление колоний с зеленым оттенком предполагает наличие синегнойной палочки. Слизистые гладкие или матовые колонии характерны для споровой микрофлоры, что свидетельствует о механическом загрязнении молока.

Для выделения и идентификации стрептококков применяют среды

Эдвардса, ТКТ и Карташовой. Из серологических методов идентификации микроорганизмов используется иммунофлюоресценция со специфическими сыворотками.

Для выделения из молока и идентификации стафилококков используют, главным образом, ДНК-новокаиновый агар, тесты Шермана, а БГКП — агары Эндо и Левина, а также жидкую элективную питательную среду Карташовой.

источник

Для исследования готовят 5-процентный раствор димастина на дистиллированной или прокипяченной теплой воде. В каждое углубление пластинки из соответствующей четверти вымени надаивают по 1 мл молока и добавляют 1 мл приготовленного раствора димастина из бутылки с пипеткой-автоматом. Смесь молока с реактивом перемешивают палочкой в каждой лунке поочередно в течение 10 — 15 секунд. При использовании пластинки МКП-2 палочка не требуется, смешивание молока с реактивом производится путем горизонтального вращения пластинки одновременно во всех лунках. Реакция учитывается по густоте желе и изменению цвета. Учет реакции по вязкости желе: — отрицательная реакция — однородная жидкость (-); — сомнительная реакция — следы образования желе (+/-); — положительная реакция — ясно видимый сгусток (от слабого до плотного), который можно выбросить из луночки палочкой при перемешивании (+). На пластинке МКП-2 при отрицательной реакции (-) образуется однородная смесь. Сомнительная реакция (+/-) — во время вращения пластинки на дне лунки заметны тонкие хлопья без тенденции образования сгустка. Положительная реакция (+) — отчетливое появление слабого или быстро образующего плотного сгустка, концентрирующегося при вращении в центре луночки. Определение pH по цвету: — оранжевый, оранжево-красный (красно-оранжевый) — нормальная реакция молока (pH 6,5 — 6,8); — желтый — повышение кислотности молока (pH 6,8); — алый, пунцовый, малиновый — ярко выраженная щелочность (pH > 7,0).

Проба с 10-процентным раствором мастидина.

Для исследования коров на мастит по молоку из удоя применяют 10-процентный раствор мастидина. В случае невозможности постановки реакции на мастит сразу после взятия пробы молока можно консервировать 2-процентным раствором бихроматокалия (из расчета 1 мл консерванта на 100 мл молока) или перекисью водорода (1 — 3 капли 30 — 33-процентного р-ра на 100 мл молока). Техника постановки пробы на пластинках МКП-1 и МКП-2 и учет результатов реакции по образованию желе проводят, как указано в п. 3.3.1. Определение pH по цвету: — светло-сиреневый, дымчатый — pH молока в норме (6,5 — 6,8); — почти белый — повышенная кислотность молока; — темно-сиреневый — повышенная щелочность молока. Для определения пораженной четверти вымени от животных, давших положительную и сомнительную реакцию с 10-процентным раствором мастидина, отбирают пробы молока из каждой четверти и исследуют с 5-процентным или 2-процентным растворами мастидина и по пробе отстаивания.

Проба с 2-процентным раствором мастидина.

Для приготовления 2-процентного раствора мастидина к 100 мл 10-процентного раствора прибавляют 400 мл дистиллированной или заранее приготовленной прокипяченной теплой воды. Постановка пробы и учет реакции проводят по образованию сгустка и изменению цвета, как при исследовании молока с 10-процентным раствором мастидина (п. 3.3.2). Образование сгустка является основным диагностическим признаком при исследовании молока по димастиновой и мастидиновой пробам, а изменение цвета является ориентирующим признаком. Показания быстрых диагностических тестов с димастином или мастидином не имеют самостоятельного значения для постановки диагноза на мастит, они в обязательном порядке должны подтверждаться пробой отстаивания .

Проводится путем отбора секрета из четвертей вымени, которые реагировали положительно на димастиновый или мастидиновый тесты. В конце доения коровы надаивают в пробирку 10 мл молока (секрета) и ставят ее на 16 — 18 часов в холодильник или в другое холодное место, чтобы за время отстоя молоко не прокисло. На второй день пробы просматривают и учитывают результат. Лучше учет проводить при дневном свете. При этом обращают внимание на наличие осадка, количество и характер сливок и цвет молока. Молоко здоровых коров имеет белый или слегка синеватый оттенок, осадка не образует. Молоко от больных маститом коров водянистое, изменяется консистенция сливок, они становятся тягучими, слизистыми, хлопьевидными. Основным диагностическим признаком при учете результатов пробы отстаивания является осадок. Образование его в отстоявшемся молоке или наличие хлопьевидных, тягучих слизистых сливок указывает на положительный результат пробы отстаивания. Корову с таким молоком считают больной маститом, ее изолируют от общего стада и подвергают лечению. Молоко из пораженной маститом четверти выдаивают руками, собирают отдельно и уничтожают. Молоко из непораженных четвертей в каждом отдельном случае бракуют в соответствии с наставлением по применению того или иного метода лечения.В Учхозе «Пригородное» имеется бойня, соответствующая ветеринарно-санитарным требованиям. Ветеринарные врачи отделений также осуществляют контроль за соблюдением технологии доения, первичной обработки молока. Также они следят за чистотой молочного оборудования и посуды, за соблюдением личной гигиены работниками животноводства. Все доярки, телятницы и скотники обеспечены спецодеждой.

На молоко выдается сертификат соответствия на один год, имеющий юридическую силу на территории России. Кроме того хозяйству ежегодно выдается ветеринарное регистрационное удостоверение на право выращивания, разведение, переработки и реализации животноводства (молока, мяса, шкур крупного рогатого скота).

источник

Методы определения соматических клеток

Milk. Methods for determination of somatic cells

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом маслоделия и сыроделия Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 46-2014 от 05 декабря 2014 г.)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 08 декабря 2014 г. N 1950-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 23453-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 января 2016 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 11, 2015 год

Поправка внесена изготовителем базы данных

Настоящий стандарт распространяется на сырое молоко и устанавливает методы определения соматических клеток.

Стандарт не распространяется на термически обработанное, фальсифицированное химическими агентами (мочевина, перекись водорода, формалин и д.р.) и подмороженное молоко, а также на сырое молоко титруемой кислотностью более 21°Т.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 745-2003 Фольга алюминиевая для упаковки. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия

ГОСТ 5262-67* Спирт этиловый ректификованный. Технические условия
_______________
* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 5962-67, здесь и далее по тексту. — Примечание изготовителя базы данных.

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 11773-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 23455-79 Препарат «Мастоприм». Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, отбор проб и подготовка их к анализу. Часть 1. Молоко, молочные и молочные составные, молокосодержащие продукты

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по [1], а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 соматические клетки : Клетки, составляющие тело (сому) многоклеточных организмов и не принимающие участия в половом размножении (все клетки животного или растения за исключением половых клеток (гамет)).

3.2 флуоресцентная микроскопия : Метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбужденных атомов и молекул образца после его облучения светом с большей частотой. Излучение образца пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флуоресцентного препарата в оптическом спектре фиксируется специальной цифровой камерой.

4.1 Отбор проб и подготовка их к испытанию — по ГОСТ 26809.1.

5.1 Сущность метода

Метод основан на воздействии сульфанола (поверхностно-активного вещества, входящего в состав препарата «Мастоприм») на клеточную оболочку соматических клеток, приводящем к нарушению ее целостности и выходу содержимого клеток во внешнюю среду. При этом изменяется вязкость (консистенция) сырого молока, что оценивают визуально.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ±0,1 г.

Колбы мерные 1(2, 3, 4)-100-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 2(3)-1 -1 по ГОСТ 29169.

Пластинки молочно-контрольные ПМК-1 и ПМК-2.

Термометр стеклянный жидкостной (нертутный) по ГОСТ 28498 диапазоном измерения от 0°С до 100°С и ценой деления шкалы 1°С.

Стаканы 1 (2)-50 по ГОСТ 25336.

Палочки стеклянные или пластмассовые с оплавленным концом диаметром не более 5 мм.

Плитка электрическая по ГОСТ 14919.

Секундомер механический или цифровой ценой деления 0,2 с.

Препарат «Мастоприм» по ГОСТ 23455.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Вода питьевая по нормативным и техническим документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

5.3.1 Приготовление кипяченой питьевой воды

Питьевую воду кипятят в течение 5-10 мин, охлаждают до температуры 30°С-35°С и используют для приготовления раствора препарата «Мастоприм».

5.3.2 Приготовление раствора препарата «Мастоприм»

2,5 г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доливают до метки дистиллированной или кипяченой питьевой водой температурой 30°С-35°С. Раствор должен быть прозрачным белого цвета. Допускается помутнение и образование незначительного осадка, который растворяется при нагреве до температуры 30°С-35°С. Раствор перед применением перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре хранения 10°С-30°С — не более 1 сут.

5.4 Проведение анализа

От тщательно перемешенной пробы анализируемого сырого молока пипеткой отбирают 1 см , помещают в луночку пластинки ПМК-1 и добавляют 1 см раствора препарата «Мастоприм».

Сырое молоко с раствором препарата «Мастоприм» интенсивно перемешивают стеклянной или пластмассовой палочкой в течение 10 с. Не прекращая интенсивного перемешивания смеси в луночке, поднимают палочку вверх на 5-7 см и визуально оценивают изменение вязкости смеси. Наблюдение ведут не более 60 с.

5.5 Обработка результатов

Количество соматических клеток в анализируемом сыром молоке устанавливают визуально по изменению вязкости (консистенции) смеси сырого молока с препаратом «Мастоприм» в соответствии с требованиями таблицы 1.

Таблица 1

Характеристика вязкости (консистенции) смеси

Однородная жидкость или слабый сгусток, который слегка тянется за палочкой

От сгустка, тянущегося за палочкой в виде нити, до выраженного сгустка, при перемешивании которого хорошо видна выемка на дне луночки пластинки. Сгусток не выбрасывается палочкой из луночки пластинки

Плотный сгусток, который выбрасывается палочкой из луночки пластинки

* Нижний предел точности визуального метода — 500 тыс. соматических клеток в 1 см сырого молока, что соответствует международно признанной границе физиологической нормы и говорит об отсутствии или незначительной примеси (до 6%) маститного молока в сборном. Для определения в сыром молоке меньшего количества соматических клеток и получения конкретных числовых значений необходимо применять инструментальные методы.

6.1 Сущность метода

Метод основан на воздействии сульфанола (поверхностно-активного вещества, входящего в состав препарата «Мастоприм») на клеточную оболочку соматических клеток, приводящем к нарушению ее целостности и выходу содержимого клеток во внешнюю среду. При этом изменяется вязкость (консистенция), что оценивают вискозиметром.

6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIMLR 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ±0,1 г.

Вискозиметр капиллярного типа, откалиброванный производителем прибора на определение количества соматических клеток в сыром молоке, с диаметром капилляра рабочего сосуда (1,50±0,05) мм и длиной капилляра (1,00±0,05) мм.

Колбы мерные 1(2, 3, 4)-100-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 2(3)-1-5(10) по ГОСТ 29169.

Секундомер электронный, тип СТЦ-2.

Стаканы 1(2)-50 по ГОСТ 25336.

Палочки стеклянные или пластмассовые с оплавленным концом диаметром не более 5 мм.

Плитка электрическая по ГОСТ 14919.

Препарат «Мастоприм» по ГОСТ 23455.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

6.3.1 Приготовление кипяченой питьевой воды

6.3.2 Приготовление раствора препарата «Мастоприм»

3,5 г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доливают до метки дистиллированной или кипяченой питьевой водой при температуре 30°С-35°С. Раствор должен быть прозрачным белого цвета. Допускается помутнение и образование незначительного осадка, который растворяется при нагреве до температуры 30°С-35°С. Раствор перед применением перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре хранения 10°С-30°С — не более 1 сут.

6.3.3 Подготовка пробы сырого молока для анализа

Перед проведением анализа устанавливают температуру сырого молока в пределах от 18°С до 22°С.

5 см раствора препарата «Мастоприм» и 10 см анализируемого сырого молока отбирают пипетками и вносят в сосуд вискозиметра. Анализируемое сырое молоко перед отбором пробы необходимо тщательно перемешать и при необходимости очистить от механических примесей.

Смесь анализируемого сырого молока с раствором препарата «Мастоприм» в сосуде вискозиметра перемешивают в течение (30±10) с в ручном или автоматическом режиме. По окончании перемешивания определяют количество соматических клеток в анализируемом сыром молоке по времени вытекания смеси из капилляра. Продолжительность вытекания определяется вязкостью смеси сырого молока с раствором препарата «Мастоприм», которая коррелирует с исходным содержанием в нем соматических клеток.

Диапазон определения количества соматических клеток при использовании капиллярных вискозиметров составляет от 90 до 1500 тыс. в 1 см сырого молока и продолжительность вытекания смеси из капилляра колеблется от 12 до 58 с, что указано в таблице 2.

Таблица 2

Продолжительность вытекания*, с

* Продолжительность вытекания смеси из капилляра вискозиметра диаметром капилляра рабочего сосуда (1,50±0,05) мм и длиной капилляра (1,00±0,05) мм.

После проведения анализа смеси для каждой анализируемой пробы сырого молока сосуд прибора следует подготовить для проведения следующего анализа согласно процедуре, описанной в инструкции по применению прибора.

6.5 Обработка результатов

За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать:

Предел допускаемой погрешности результатов измерений составляет 10% в интервале доверительной вероятности Р =0,95.

7 Метод контроля соматических клеток флуоресцентной микроскопией с использованием анализатора соматических клеток DCC

7.1 Сущность метода

Метод основан на разрушении цитоплазматической мембраны соматических клеток под действием лизогенного буфера. При этом ядра клеток становятся доступными для действия флуоресцентного красителя, в качестве которого используется йодид пропидия. Йодид пропидия связывается с двухспиральной ДНК соматических клеток, и образует флуоресцентное вещество, поглощающее зеленый свет и излучающее красный, идентифицирующее клетки. Система дает изображение клеток, а встроенный в анализатор компьютер с помощью программного обеспечения подсчитывает количество белых точек, что соответствует количеству соматических клеток.

7.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы

Анализатор клеток DCC, работающий на принципе флуоресцентной микроскопии, оснащенный приемным устройством для кассеты (съемная оправка), жидкокристаллическим дисплеем с подсветкой, в комплекте с кассетами (Nucleo-кассета), флаконами для проб.

Nudeo-кассета, откалиброванная по объему, состоящая из поршня, проточной системы с флуоресцентным красителем йодидом пропидия и измерительной камеры.

Проверочная кассета с определенным фиксированным количеством имитаторов соматических клеток.

Термометр стеклянный жидкостной (нертутный) по ГОСТ 28498, диапазоном измерения от 0°С до 100°С и ценой деления шкалы 1°С.

Флакон для проб.

Стаканы 1(2)-50 по ГОСТ 25336.

Палочки стеклянные или пластмассовые с оплавленным концом диаметром не более 5 мм.

7.3 Подготовка к проведению измерений

Тестирование анализатора DCC и партии кассет проводят в соответствии с приложением А.

7.4 Проведение измерений

Аккуратно перемешивают пробу сырого молока во флаконе для проб или стеклянном стакане при помощи стеклянной палочки, не допуская вспенивания. Температура пробы молока должна быть в диапазоне от 10°С до 40°С.

Вскрывают пакет с Nucleo-кассетой и вынимают ее для проведения измерений. Nucleo-кассета не должна находиться на свету более 3 мин.

Набирают сырое молоко в Nucleo-кассету, опуская всасывающее устройство кассеты во флакон с пробой сырого молока и нажимая на поршень. Сырое молоко должно дойти до половины дорожки 3.

Помещают кассету в счетчик так, чтобы всасывающее устройство располагалось слева, после чего закрывают крышку отсека для кассеты.

Проводят измерение в режиме «Run».

Через 1 мин фиксируют результат, отображенный на дисплее прибора.

7.6 Контроль точности результатов измерений

7.6.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в различных лабораториях, различными операторами с использованием различного оборудования, при уровне доверительной вероятности Р =0,95 не должна превышать 15%.

8.1 Сущность метода

Метод основан на высушивании распределенной на предметном стекле анализируемой пробы сырого молока с последующим окрашиванием мазка и подсчете с использованием микроскопа количества окрашенных соматических клеток на установленной площади.

8.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ±0,2 мг.

Бани водяные с терморегулятором, позволяющим поддерживать температуру (40±2)°С, (50±2)°С, (65±2)°С.

Микроскоп световой биологический с увеличение от 500 до 1000 . Допускается использовать масляно-иммерсионные объективы.

pH-метры или иономеры, имеющие следующие технические и метрологические характеристики: диапазон измерений от 0 до 12 (14) ед. pH, ручную и/или автоматическую термокомпенсацию, пределы допускаемого значения основной (абсолютной) погрешности преобразователя не более ±0,02 ед. рН.

Микрошприц типа МШ-10, для дозирования установленного объема молока 0,01 см , с максимальной погрешностью ±2%.

Стекла предметные, с предварительно нанесенным очерченными прямоугольными контурами, площадью от 95 до 105 мм или стандартное предметное стекло размером 20х5 мм или стекла с шаблоном.

Стеклянные емкости с плотно притертыми крышками для хранения растворов красителя.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фольга алюминиевая по ГОСТ 745.

Чашки Петри ЧБН-1-100 или ЧБН-2 по ГОСТ 25336.

Колба коническая Кн-2-250 ТС по ГОСТ 25336.

Пинцет.

Спиртовка СЛ-1 по ГОСТ 25336.

Цилиндры 1(2)-50(100)-1 по ГОСТ 1770.

Ксилол, массовой долей основного вещества не менее 99,5%.

Метиленовый синий, индикатор.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5262 и спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.

Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч. или ледяная.

Хлорид натрия по ГОСТ 4233, х.ч. или ч.д.а.

Калий хлористый по ГОСТ 4234, х.ч. или ч.д.а.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 7-водный по ГОСТ 11773, ч.д.а.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч. или ч.д.а.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или деминерализованная.

8.3.1 Приготовление окрашивающего раствора

В конической колбе вместимостью 250 см смешивают 54,0 см этанола объемной долей 95% и 40,0 см ксилола, колбу закрывают алюминиевой фольгой. Смесь нагревают на водяной бане до температуры (65±1)°С. В вытяжном шкафу в смесь добавляют 0,6 г метиленового синего и тщательно перемешивают. Смесь охлаждают до температуры (4±1)°С.

Затем добавляют 6,0 см ледяной уксусной кислоты и вновь тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр и помещают в герметичный сосуд на хранение.

8.3.2 Приготовление фосфатного буферного раствора

В мерной колбе вместимостью 1000 см в деминерализованной воде растворяют 8,0 г хлористого натрия, 0,2 г хлористого калия, 1,15 г двузамещенного фосфата натрия и 0,2 г однозамещенного фосфата калия. Доводят объем метки деминерализованной водой.

Устанавливают активную кислотность раствора на уровне (7,2±0,1) ед. pH.

Примечание — Допускается использовать готовый буферный раствор с активной кислотностью, равной 7,2 ед. pH.

8.3.3 Приготовление анализируемой пробы

До проведения определения анализируемые пробы сырого молока хранят при температуре (4±2)°С. Определение проводят в течение 6 ч после отбора проб.

100 см анализируемой пробы сырого молока нагревают на водяной бане до температуры 40°С, постоянно перемешивая, охлаждают до температуры 20°С.

Разбавляют анализируемую пробу фосфатно-буферным раствором до получения соматических клеток на уровне 500 тыс. клеток/см .

Для каждой разбавленной пробы рассчитывают коэффициент разбавления по формуле

где d — коэффициент разбавления для получения надлежащего количества соматических клеток в анализируемой пробе, примерно 500 тыс. клеток/см ;

— объем анализируемой пробы, см ;

— объем буферного раствора, используемого для разбавления анализируемой пробы, см .

Записывают коэффициент разбавления d , объем анализируемой пробы и объем буферного раствора , используемый для получения нужного разбавления.

8.4 Проведение анализа

Для каждой анализируемой пробы готовят не менее двух мазков и отбирают стандартный.

8.4.1 Приготовление мазка

Перед приготовлением мазка предметное стекло необходимо обезжирить и простерилизовать. Для этого предметное стекло погружают в 95%-ный раствор этанола и стерилизуют пламенем, после чего охлаждают.

Используя микрошприц, отбирают 0,01 см анализируемой пробы (при необходимости разбавленной). Микрошприц промывают анализируемой пробой. При необходимости тщательно и аккуратно очищают внешнюю сторону микрошприца, которая контактировала с анализируемой пробой.

Смесь помещают на чистое предметное стекло площадью 1 см . Используя иглу, равномерно распределяют анализируемую пробу на всей указанной поверхности, при этом контролируют, чтобы площадь, прилегающая к внешним границам, была также равномерно покрыта. Мазок подсушивают при комнатной температуре до состояния полной сухости.

Высушенный на предметном стекле мазок погружают в окрашивающий раствор метилового синего и выдерживают в нем в течение 15-30 мин. Высушивают мазок при комнатной температуре.

Затем осторожно смывают излишки красителя в стакане с водопроводной водой. Высушивают вновь и хранят в условиях защиты от пыли.

Срок хранения предметных стекол с мазками — не более 12 мес.

8.4.2 Подсчет соматических клеток

8.4.2.1 Общие положения

Используя микроскоп, подсчитывают соматические клетки в полученном мазке по 8.4.1 в полях микроскопа, целиком заполненных мазком молока. Выбирают наилучшее увеличение (от 500 до 1000 ).

Подсчету подлежат соматические клетки, к числу которых относятся: макрофаги (размер клеток 8-30 мкм), полиморфоядерные нейтрофилы (размер клеток 10-14 мкм), лимфоциты (размер клеток 5-10 мкм), лейкоциты (размер клеток 5-10 мкм) и эпителиальные клетки (размер клеток 10-14 мкм). Количество соматических клеток подсчитывается в целом, поэтому нет необходимости дифференцировать их между собой.

Примечания

1 Лаборант должен уметь отличать соматические клетки от бактериальных, а также клеток дрожжей, плесневых грибов и от жировых шариков.

2 Под микроскопом бактериальные клетки, не зависимо от формы, имеют значительно меньший размера, чем соматические. Их размер колеблется от 0,3 до 4-5 мкм.

3 Дрожжи имеют клетки круглой, овальной или продолговатой формы, часто почкующиеся, с выраженным ядром или без него, зерненные или нет, размером 2,5-10х2,5-30 мкм. Соматические клетки труднее всего дифференцировать от клеток дрожжей, однако, они в среднем более крупные и в препаратах имеют неровный и менее прокрашенный край.

4 Споры плесневых грибов размером с бактериальную клетку и имеют круглую, овальную или яйцевидную форму. Гифы (вегетативные тела) обычно крупные 5-50 мкм, однако имеют характерную палочковидную форму с перегородками или без них и хорошо отличаются от соматических клеток.

5 Жировые шарика имеют окрашенные контуры и слабую окраску внутри, крупных размеров и создают фон, на котором просматриваются соматические и бактериальные клетки.

Не следует подсчитывать клетки с размером менее 8 мкм. Фрагменты клеток подсчитывают как одну клетку, если ядра четко не разделены.

8.4.2.2 Подсчет в последовательных полях микроскопа

Подсчитывают соматические клетки в последовательных полях, в вертикальных полосах на равномерно размещенных полях.

Подсчет начинают приблизительно на расстоянии d =0,5 мм от левой стороны.

Помещают нижний (верхний) край окружности поля микроскопа к внутренней нижней (верхней) границе мазка.

После подсчета первого поля объектив передвигают на установленное расстояние d вверх или вниз до следующей градации и подсчитывают новое поле. Расстояние d =1 мм считается пригодным.

Так повторяют вплоть до достижения противоположной стороны полосы.

Выбирают один из двух приведенных вариантов:

— последнее поле не подлежит подсчету;

— подсчет проводится после передвижения объектива до полного исчезновения границы мазка с поля, если появляется верхняя или нижняя граница мазка и она заполняет менее половины поверхности поля.

Затем объектив передвигают вправо на расстояние d =1,5 мм или d =2 мм в зависимости от необходимого числа полей и начинают работать с новой полосой в противоположном направлении. Операции повторяют до достижения правой стороны шаблона.

(Поправка. ИУС N 11-2015).

Результат определяют в соответствии с формулой (2).

Примечание — В случае прямоугольной формы возможно расположение 5 полей на 1 мм в вертикальных полосах и 10 полос, расположенных на расстоянии 2 мм, что позволяет подсчитать 50 полей.

8.4.2.3 Подсчет в прямоугольной форме по полосам

Соматические клетки подсчитывают в расположенных с равными интервалами вертикальных полосах.

Подсчет начинают приблизительно на расстоянии d от левой стороны. Расстояние d =0,5 мм считается пригодным.

Начинают подсчитывать от верхней или нижней границы прямоугольной площади. Помещают границу поверхности в центр зрения микроскопа. После подсчета всех клеток объектив передвигают в направлении, противоположном границе, и подсчитывают все клетки, видимые в этой полосе, вплоть до достижения противоположной границы. Записывают число подсчитанных клеток.

Затем объектив передвигают вправо на расстояние d и начинают подсчет новой полосы (например, d =3-4 мм в зависимости от необходимого числа полей для репрезентативного подсчета всего мазка).

Операции повторяют до достижения правой стороны шаблона.

Результат подсчитывают, как указано в 8.5.

8.5.1 Подсчет для прямоугольной формы в последовательных полях

Проверяют контрольные значения 20,0 и 5,0 мм для длины L и ширины W мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа.

Рассчитывают общую концентрацию клеток, используя следующее уравнение

N — общее количество подсчитанных клеток, шт.;

D — диаметр поля микроскопа, мм;

N — количество полностью подсчитанных полей, шт.;

V — объем испытуемой пробы мазка, равный 0,01 см

d — коэффициент разбавления, используемый в 6.3.3.

8.5.2 Подсчет для прямоугольной формы в полосах

Проверяют контрольные значения 20,0 и 5,0 мм для длины и ширины мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа.

Рассчитывают общую концентрацию с клеток, используя следующее уравнение

где N — количество полностью подсчитанных полос.

Остальные обозначения приведены в 8.5.1

8.6 Прецизионность

Точность настоящего метода установлена с учетом требований нормативных документов, действующих на территории государств, принявших стандарт*.
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».

Значения, полученные для повторяемости и воспроизводимости, выражены при уровне вероятности Р =95%.

8.6.1 Повторяемость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5% случаев превышать значения, приведенные в таблице 3.

Таблица 3 — Значения повторяемости

источник