Скрытый мастит у коров сопровождается вяло протекающим воспалительным процессом, при котором клинические признаки мастита выражены очень слабо, а то вообще не проявляются.
На крупных молочных комплексах подобная форма патологии широко распространена и практически ветспециалистами сельскохозяйственных предприятий обычно диагностируется во время проведения ежемесячных исследованиях дойного стада на скрытую форму мастита. При машинном доении скрытым маститом поражается до 15% лактирующих коров.
Этиология. Причины возникновения скрытых маститов разнообразны. В сельхозпредприятиях скрытые маститы наиболее часто возникают при несоблюдении операторами машинного доения ветеринарно-санитарных правил доения коров, при неправильном запуске, несоблюдении курса лечения маститных животных.
При скрытом мастите происходит расстройство функции молочной железы, клинически проявляющееся гипогалактией и изменением биохимических свойств молока. Объективным показателем здорового вымени у коровы является количество содержащихся соматических клеток в молоке. Соматические клетки молока являются нормальным компонентом в качественном молоке. Соматические клетки в молоке коровы представлены лейкоцитами и эпителием альвеол и молоко выводящих путей молочной железы. Если в секрете молока от здоровой коровы преобладают эпителиальные клетки, которые образуются в тканях вымени в процессе естественного старения и обновления тканей, то при мастите происходит усиление миграции лейкоцитов в очаг воспаления, что в конечном итоге приводит к резкому возрастанию соматических клеток в молоке. Если в 1мл молока от клинически здоровых коров содержится в среднем 250тысяч соматических клеток, то при заболевании маститом их количество возрастает до 950тысяч. Молоко от коров больных субклиническим маститом имеет пониженную кислотность (до 8-12 градусов по Тернеру, реакция молока становится слабощелочной, происходит увеличение содержания хлоридов, альбуминов и глобулинов, в несколько раз увеличивается количество клеточных элементов, особенно лейкоцитов. Одновременно происходит уменьшение содержания сухих веществ (казеина, лактозы, кальция и фосфора).
При попадании молока от коров больных скрытой формой мастита в общий удой делает его непригодным для приготовления сыров, молочнокислой продукции и крайне отрицательно сказывается на здоровье человека.
Скрытые маститы могут быть причиной в дальнейшем клинически выраженных маститов, но в основной своей массе остаются незамеченными доярками, и ветспециалистам до очередной проверки дойного стада на скрытую форму мастита, постепенно приводя корову к гипогалактие, агалактие в связи с гибелью части клеток секреторного эпителия молочной железы и регенерации за счет соединительной ткани и даже атрофии пораженной доли вымени. При проведении глубокой пальпации в пораженной четверти в отдельных случаях ветспециалист может обнаружить отдельные очаговые уплотнения тканей вымени, сужение емкости цистерны и соскового канала, утолщение стенок соска.
Диагностика. Экспресс — диагностика субклинического мастита в лактационный период основана на определении количества соматических клеток в молоке, а также посредством оценки реакции диагностических реактивов (2% раствор мастидина, 5% раствор димастина, мастоприма, 2% раствор мастотеста, с калифорниским тестом, кено тестом) с пробой молока. Проведение реакции с диагностическим реактивом осуществляется с использованием молочно-контрольной пластинки (МКП-1 или МКП-2). Для этой цели из каждой доли молочной железы выдаиваем в соответствующие лунки МКП по 1мл молока, затем добавляем по 1мл одного из одного вышеуказанных реактивов при помощи стеклянной палочки смешиваем их. Учет реакции проводим в течение 15-20сек по образованию желеобразного сгустка или изменению цвета смеси.
При наличии воспалительного процесса, в молочной железе образуется хорошо сформированный желеобразный сгусток (от умеренного до плотного), при этом сгусток хорошо выбрасывается палочкой из луночки пластинки при перемешивании.
Экспресс-диагностику субклинического мастита с целью исключения раздражения вымени, представляющую собой кратковременную реакцию молочной железы, возникающую в ответ на нарушение технологии машинного доения, воздействие ряда неблагоприятных факторов внешней среды проводим дважды с 48-часовым интервалом, когда после устранения вышеуказанных неблагоприятных факторов в течении 48часов молочная железа приходит в норму. При этом больными маститами считаем тех коров, которые дважды дают положительную реакцию с одним из диагностик умов.
Дополнительным методом исследования на мастит служит проба отстаивания, положительный результат которой говорит о скрытой форме мастита. Для выполнения данной пробы специалист берет в пробирки 10-15мл молока из тех долей вымени, которые дали положительные реакции с маститными тестами и ставит данные пробирки в штативе на 16-18 часов в холодильник или другое холодное место где имеется температура 4-10градусов. Учет реакции проводим путем просмотра пробирок с молоком при дневном освещении.Молоко из здоровых долей имеет белый или слегка синеватый цвет, а осадок отсутствует. Молоко из долей больных скрытым маститом дает образование на дне пробирки осадка, при этом слой сливок уменьшается, они становятся тягучими, слизистыми, хлопьевидными.
В сухостойный период и во время запуска диагностика основана на проведение клинического обследования молочной железы, органолептической оценке секрета, определении в молоке и секрете количества соматических клеток, оценке реакции с одним из вышеуказанных диагностических реактивов, постановке пробы отстаивания.
Всех коров в последний день запуска ветспециалист хозяйства или госветслужбы обследует клинически. При отсутствии клинических признаков мастита (увеличение доли, болезненности, уплотнения тканей, изменение секрета и повышение местной температуры), ветспециалист проводит исследования секрета из каждой четверти вымени по одному из вышеуказанных быстрых маститных тестов и ставит пробу отстаивания.
В сухостойный период обследование молочной железы проводят дважды: через 10-15дней после запуска коровы и за 10-15дней до ожидаемого отела. При выявлении больных скрытой формой мастита проводим лечение.
В последние годы, учитывая, что работа по исследованию дойного стада на скрытую форму мастита очень трудоемка, а также запросы специалистов с мест с целью облегчения работы ветспециалистам в сельскохозяйственных предприятиях по диагностике скрытых форм мастита ученые предложили использовать электронные методы выявления субклинических маститов. Данные методы основаны на том, что при маститах происходит повышение содержания уровня ионов хлора в молоке, которые в свою очередь вызывают снижение электрического сопротивления молока. Мы Ветспециалисты Гороховецкой ветстанции, чтобы подтвердить эффективность и достоверность получаемых данных при исследовании дойного стада на скрытую форму мастита провели тестирование данного прибора «Маститон» в сельскохозяйственном предприятие ООО» Лукьяново».
Для исследования на скрытую форму мастита во время проведения контрольной дойки брали от 15 до 20мл молока из каждой четверти функционирующих долей вымени. Для этого в прибор после подмывания дояркой вымени сдаивали первые порции молока непосредственно в чашку прибора так, чтобы электроды прибора были полностью закрыты молоком. После этого нажимали кнопку включения, удерживая ее в нажатом состоянии 1-2секунды, до установления показателей на дисплее ЖКИ. Записав показатели прибора в специально заведенном журнале исследования дойного стада на скрытую форму мастита, с указанием инвентарного номера исследуемой коровы, приступаем к исследованию других долей вымени.
Прибор «Маститон» имеет достаточно широкий диапазон данных на ЖКИ дисплее (от 000 до 1999 единиц), позволяя практическим ветспециалистам достаточно точно интерпретировать результаты исследования на мастит:
- при показаниях на дисплее значений 450 единиц и ниже — данный образец молока из исследуемой доли вымени, говорит о том, что молоко высокого качества; а вероятность субклинического мастита крайне низка.
- при показаниях 450- 600 единиц говорит нам о том, что в исследуемой доле существует вероятность возникновения скрытой формы мастита.
- при показаниях на дисплее выше 600 единиц говорит о наличии в данной доле вымени скрытой формы мастита и чем выше показатели на дисплее, тем большая вероятность существует у данной коровы перехода субклинического мастита в клиническую форму.
Учитывая, что при однократном исследовании нельзя определить по каждой корове какое-либо фиксированное число, по которому бы ветспециалист мог однозначно определить наличие или отсутствие у данной коровы субклинического мастита, мы вынуждены будем провести многократные исследования в динамике. И по каждому конкретному случаю проследить наличие увеличения или уменьшения показателей на дисплее. По каждому проведенному исследованию его результаты записываем в карточку конкретной коровы.
Чтобы определить границы «здоровое молоко-субклинический мастит» при показаниях прибора около 600 единиц проводили пробу с кено тестом, которая давала положительную реакцию на скрытый мастит. В результате проводимых исследований при помощи прибора «Маститон» в результате повышения уровня ионов хлора в молоке показала нам возможность выявить тенденцию возникновения скрытого мастита еще до того как проба с кено тестом будет давать положительную реакцию на мастит.
Прибор не дает однозначной цифры, выше значений которой специалист должен приступать к лечению коровы. К расшифровке результатов обследования каждого животного следует подходить строго индивидуально т.к. небольшие отклонения от приведенных выше показателей не обязательно свидетельствуют о наличие у коровы мастита. На показатели прибора оказывают влияние- жирность молока, рацион кормления коровы, условия содержания. К примеру у коровы имеющей наибольшую жирность молока в отличие от других коров показатель на дисплее будет выше среднего чем по стаду. У коров 9- летнего возраста и старше в молоке физиологически увеличивается содержание натрия хлорида и количество соматических клеток. В результате чего имеем завышенные показания прибора. У таких коров очень важно обследовать молоко из всех 4-х долей и если три доли дают показание на дисплее прибора 450 единиц, а одна-590, то данный показатель говорит нам о риске заболевания маститом в доле с наибольшим показателем.
С целью выявления субклинического мастита и наблюдения за здоровьем вымени ветспециалистам необходимо вести наблюдения за динамикой изменений показателей электропроводности молока по дисплею ЖКИ прибора «Маститон» у каждой коровы.
Например, у дойной коровы с инв.№1183 при проведении контрольных доек показатели на дисплее по трем четвертям вымени идут в диапазоне 450-550 единиц, а в четвертой доле 600 единиц, то данный показатель будет говорить нам о наличии скрытого мастита в данной доле, а для коров имеющих обычно показатели в интервале от 400 до 500 единиц, получение результата на дисплее 550 и более единиц будет служить показателем о появлении скрытого мастита.
Если при исследовании дойного стада на скрытую форму мастита мы получим показатели 600 единиц и более, то мы должны будем у данного животного перейти к регулярным исследованиям вымени на скрытую форму мастита т.к. данные показатели нам говорят о наличии у коровы мастита или механической травмы вымени.
Отдельные коровы переболевшие маститом, могут длительное время показывать результаты на дисплее 500 единиц и более даже после полного клинического выздоровления, т.к. это связано с последствиями воспаления молочной железы.
Полученные с помощью прибора Маститон данные позволяют практическим ветврачам, да и фермерам своевременно отбирать больных животных из стада, проводить их углубленное обследование на мастит и при его наличие назначать соответствующее лечение.
Если во время контрольной дойки мы выявим большое количество коров показывающих результат 500 единиц и выше, то специалистам хозяйства необходимо провести анализ заболеваемости коров маститами (смотри статью анализ заболеваемости коров маститами в сельскохозяйственном предприятии).
Лечение. Больную субклиническим маститом корову переводим с машинного доения на ручное.
При проведении ручного доения делаем массаж вымени. Применяем методы физиотерапии (аппликации на вымя озокерита, парафина, согревающие повязки (навымник), компрессы, прогревание лампами солюкс, инфраруж и др.).
Проводим лечение с использованием лазерных аппаратов различных модификаций. При использовании лазерного аппарата «СТП» и «ЛАПА» продолжительность одного сеанса в минутах для «СТП»-4-5минут, для «ЛАПЫ»-1минута, курс лечения состоит из 3-4 сеансов по 1 сеансу в день.
Внутримышечно вводим антибиотики: тилозин 200 один раз в день по 8-10мл-3дня. Билозин 200 (инъекционный раствор макролидного антибиотика тилозина в форме основания), в 1мл содержится 200мг тилозина основания (20%). Применяем в дозе 0,5мл на 10кг массы тела животного 2 раза в день (молоко нельзя использовать для пищевых целей в течении 7дней).
Эфикур из расчета 1мл на 50кг массы тела животного подкожно в течении 2-3дней. Можно применять традиционные антибиотики, предварительно проверив молоко из пораженной четверти вымени на чувствительность к антибиотикам.
Внутривымянно применяем Мастиет-форте 10мл в пластмассовом шприце.
Неплохие результаты получают от внутривымянного введения 150 мл парного высоколизоцимного молока (полученного от здоровых коров) 1-2 раза в день в течении 2-3дней.
Рекомендуются блокады вымени с использованием раствора новокаина и тримекаина.
Профилактика. В сухостойный период — проводим запуск коров за 1,5-2 месяца до предполагаемого отела. Запуск начинаем с ограничения дачи сочных кормов и концентратов до 50% рациона. Коров с трехкратного доения переводим на двукратное, затем на однократное, после этого корову начинаем доить через день и прекращаем совсем. У высокопродуктивных коров, которые обычно трудно запускаются, иногда приходится из рациона исключать полностью сочные и концентрированные корма и ограничивать водопой.
Ввиду того, что заболевание коров субклиническим маститом очень часто встречается в период запуска и сухостоя владельцы животных и специалисты хозяйств должны усилить контроль за состоянием вымени в эти периоды. Специалисты должны один раз в две недели проводить клиническое обследование вымени с пробным сдаиванием секрета из молочных четвертей.
В ряде хозяйств Ветспециалисты с целью профилактики послеродовых маститов при запуске коров применяют внутривымянное введение антибактериальных препаратов. Причем обычно вводят препараты длительного спектра действия (бициллин-3 в дозе 300тыс ЕД в каждую запускаемую четверть, Мастикур, мастицид,Мастиен- форте, Мамифорт Секадо по одному шприцу содержащему 10мл. препарата в каждую четверть вымени, а также другие антибактериальные средства).
источник
| Г. М. Свириденко, д. т. н., ГНУ «ВНИИМС РАН», e-mail: mail@vniims.info |
| Статья посвящена разработке межгосударственного стандарта на методы определения соматических клеток. |
На протяжении последних 10 лет во ВНИИМС ведутся постоянные исследования молока сырого, производимого в хозяйствах Угличского района Ярославской области, а также в ряде хозяйств других областей Центрального и Северо- Западного регионов РФ, по всему комплексу показателей, значимых для выпуска безопасных, качественных и хранимоспособных молочных продуктов.
Во всем мире, в том числе в нашей стране, проблема маститов стоит на одном из первых мест, определяющих безопасность и санитарно-гигиенические показатели молока.
Содержание соматических клеток – важнейший косвенный показатель здоровья вымени, так как при воспалительном процессе в молоке резко увеличивается количество клеток крови, в частности лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, которые могут поглощать клетки патогенных микроорганизмов – возбудителей мастита и в молочной железе играют защитную функцию.
Наряду с клетками крови к соматическим относятся любые клетки организма, кроме половых. Клетки вымени (эпителиальные) попадают в молоко естественным путем из молоковыводящих каналов в ходе старения и обновления эпителия и являются постоянной составной частью молока. В молоке здоровой коровы их содержание составляет 60–70 % от общего количества соматических клеток и не влияет на качество и безопасность. Нормальное фоновое содержание соматических клеток в молоке колеблется в зависимости от возраста, периода лактации, породы и индивидуальных особенностей животного от 100 до 500 тыс. соматических клеток в 1 см3 нормального молока. Наличие в молоке из отдельной доли вымени менее 500 тыс. в 1 см3 соматических клеток при отсутствии патогенных бактерий свидетельствует о нормальной секреции, при наличии патогенов – о скрытой инфекции вымени. В международной практике установлена верхняя граница допустимого содержания соматических клеток в молоке из одной четверти вымени 5⋅105 клеток. Для сборного молока границу устанавливают обычно ниже – от 3⋅105 до 5⋅105 клеток в 1 см3.
В соответствии с Федеральным законом от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» и Федеральным законом от 22 июля 2010 г. № 163-ФЗ «О внесении изменений в Федеральный закон “Технический регламент на молоко и молочную продукцию”» содержание соматических клеток в молоке высшего сорта не должно превышать 4⋅105 клеток в 1 см3, а в молоке первого и второго сортов – 1⋅106 клеток в 1 см3. По данному показателю сыропригодным может быть только молоко высшего сорта. В техническом регламенте Таможенного союза допусти- мая норма содержания в молоке сыром соматических клеток – 7,5⋅105 в 1 см3, при этом для молока сырого, предназначенного для производства детского питания, сыров и стерилизованного молока, – не более 5⋅105 клеток в 1 см3.
Очень важно, что содержание соматических клеток в молоке можно легко и быстро определить. Для выявления в заготовляемом сырье примеси маститного молока используются прямые и косвенные методы, основанные на установлении количества соматических клеток. К косвенным методам определения количества соматических клеток в молоке относятся методы их выявления при взаимодействии с рядом реагентов. В настоящее время определение количества соматических клеток в молоке регламентируется ГОСТ Р 54077-2010 «Молоко. Методы определения количества соматических клеток по изменению вязкости» и проводится с использованием диагностических препаратов типа «Мастоприм» визуальным способом и с применением вискозиметра. Стандарт разработан ГНУ «ВНИИМС Россельхозакадемии» и используется при приемке молока на всех молокоперерабатывающих предприятиях РФ.
Метод основан на воздействии сульфанола – поверхностно-активного вещества, входящего в состав препарата «Мастоприм», – на клеточную оболочку соматических клеток, что приводит к нарушению ее целостности и выходу содержимого клеток во внешнюю среду. При этом изменяется вязкость (консистенция), что фиксируется визуально или вискозиметром. Для анализа используются пластинки ПМК-1 с последующей визуальной оценкой или вискозиметры капиллярного типа, откалиброванные производителем прибора на определение количества соматических клеток в сыром молоке.
Визуальная оценка крайне проста и надежна, так как не зависит от «капризов» прибора, однако не дает возможности получить конкретные цифровые показатели количества соматических клеток в молоке. При визуальной оценке мы можем определить только границы безопасности:
Большинство предприятий в настоящее время имеет возможность применять вискозиметры тех или иных производителей для контроля соматических клеток в молоке. При этом они имеют конкретные цифровые показатели в диапазоне от 9⋅104 до 1,5⋅106 клеток в 1 см3 молока.
Однако наши исследования показывают, что на значения вискозиметров большое влияние оказывает фальсификация молока сырого как химическими веществами, так и путем воздействия температурой:
Эти особенности необходимо учитывать при анализе получаемых результатов. Опыт работы многих предприятий свидетельствует о том, что при контроле соматических клеток в молоке с использованием вискозиметра в журналах фиксируются значения менее 90 тыс. в 1 см3, которые специалисты, принимающие молоко на предприятии, считают нормой и относят данное молоко к высшему сорту. Такие выводы являются очень опасным заблуждением, так как в норме для сборного молока показатель соматических клеток менее 200 тыс. в 1 см3 у стада на территории РФ не наблюдается. Чтобы получить такой уровень соматических клеток в сборном молоке, необходимо иметь стадо перводоек в первые 3–4 мес после лактации.
Показания вискозиметра менее 90 тыс. в 1 см3 говорят о фальсификации молока или об иных отклонениях от нормы.
Существует косвенный метод определения соматических клеток в молоке сыром, основанный на принципе флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DCC фирмы DeLaval. В настоящее время данный метод не включен ни в один национальный стандарт, поэтому на основании законодательства РФ может использоваться только для проведения внутрипроизводственного контроля, а результаты анализов не могут быть использованы в случае арбитражных споров. Однако данный метод широко используется молочными хозяйствами в странах как Европы, так и Таможенного союза.
В отделе микробиологии ВНИИМС в результате многолетней работы в рамках темы Россельхозакадемии «Создать систему контроля молока-сырья и разработать исходные требования к молоку-сырью для сыроделия» накоплен значительный экспериментальный материал по сравнительной оценке всех существующих методов определения соматических клеток. Это позволило, проведя статистический анализ результатов определения соматических клеток в молоке сыром разными методами, дать предложение о включении метода флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DeLaval DCC наряду с методами контроля по изменению вязкости в программу международной стандартизации.
Сущность метода заключается в том, что цитоплазматическая мембрана соматических клеток разрушается под действием лизогенного буфера, после чего ядра клеток становятся доступными для действия флуоресцентного красителя, в качестве которого используется пропидий йодид (PropidiumIodide – PI). Пропидий йодид связывается с двухспиральной ДНК соматических клеток, и образуется флуоресцентное вещество, поглощающее зеленый свет и излучающее красный, идентифицирующее клетки. Таким образом, система дает изображение клеток, а встроенный в анализатор компьютер с помощью программного обеспечения подсчитывает количество белых точек, что соответствует количеству соматических клеток.
Nucleo-кассета – одноразовое приспособление, состоящее из проточной системы, поршня и измерительной камеры, где непосредственно происходит анализ. Флуоресцентный краситель пропидий йодид зафиксирован в первых трех каналах проточной системы Nucleo-кассеты.
При заполнении Nucleo-кассеты образцом молока оно смешивается с флуоресцентным красителем PI и клеточные ДНК окрашиваются. После размещения Nucleo-кассеты в приборе окрашенная смесь автоматически попадает в измерительную камеру. После анализа образец и PI остаются внутри Nucleo-кассеты, которую можно безопасно утилизировать. Это обеспечивает безопасное проведение анализа. Кроме того, использование Nucleo-кассет исключает необходимость очистки прибора и его технического обслуживания.
В рамках данной работы проведены исследования влияния различных факторов на результаты определения количества соматических клеток, получаемые методом, основанным на принципе флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DCC фирмы DeLaval:
Сравнительная оценка результатов контроля количества соматических клеток в молоке параллельно тремя косвенными методами представлена в табл. 1.
Как видно из табл. 1, доля проб молока, соответствующих требованиям безопасности, при анализе одной и той же выборки зависит от метода определения количества соматических клеток и его чувствительности. Сравнительная статистическая оценка методов определения количества соматических клеток в сыром молоке проведена с использованием непараметрического критерия знаков Z и критерия Уилкоксона Т.
С вероятностью 95 % можно утверждать следующее:
С учетом полученных данных в проект межгосударственного стандарта были включены три перечисленных косвенных метода контроля соматических клеток в молоке.
Всероссийским научно-исследовательским институтом сертификации на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта создан ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010 «Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (контрольный метод)», идентичный международному стандарту ИСО 13366-1:2008 «Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (контрольный метод)» [ISO 13366-1:2008 « M i l k – E nu m e r at i o n o f s o m at i ccel l s – Pa r t 1 : Microscopicmethod (Referencemethod)»]. Данный стандарт устанавливает метод подсчета соматических клеток с применением микроскопа в сыром и химически консервированном молоке.
Использование этого стандарта сопряжено с применением опасных материалов, требует специального оснащения приборами и оборудованием. На пользователя данного стандарта возлагается вся ответственность по установлению надлежащих правил безопасности, охраны здоровья и определения применимости регулятивных ограничений, разработанных до использования.
Подготовка и профессиональное мастерство микробиолога являются основными решающими факторами успешного использования метода. Для обеспечения надлежащего уровня подсчета необходимы как теоретические знания, так и большие практические навыки. Метод крайне трудоемкий, а время проведения одного анализа составляет не менее 3–4 ч.
Результаты, полученные в рамках совместных международных исследований коровьего молока в 2005 г. при разработке стандарта ISO 13366-1:2008, в которых приняли участие 18 лабораторий из 13 стран, говорят о том, что данный метод может быть реализован только в условиях специализированных лабораторий. Подтверждением сказанного служат результаты анализа восьми проб молока в 18 контрольных лабораториях Европы. Данные испытаний показывают, что из 144 проб (по восемь проб в 18 лабораториях) пригодными для статистического анализа были признаны только 95, а 49 участников были исключены по причине резко отклоняющихся результатов.
Есть негативные примеры использования данного метода в молочной промышленности, в частности на предприятиях Украины, пытающихся достичь гармонизации с международными стандартами и проверяющих правильность работы вискозиметров, сравнивая их результаты с описанным методом микроскопического подсчета соматических клеток. В отделе микробиологии ВНИИМС была проведена большая работа по оценке метода прямого микроскопирования соматических клеток в молоке в соответствии с упомянутыми стандартами.
Всесторонняя оценка как самого метода, так и получаемых результатов при контроле одной и той же пробы молока разными операторами позволила нам сделать вывод о невозможности применения данного метода в условиях производственных лабораторий для контроля молока-сырья. Коротко данный метод можно охарактеризовать как крайне трудоемкий, опасный для здоровья, длительный и плохо воспроизводимый.
Однако метод прямого микроскопирования является единственным прямым методом контроля, позволяющим увидеть, идентифицировать и сосчитать соматические клетки в молоке.
Поэтому мы провели модификацию метода в целях его упрощения и снижения уровня опасности. Разработанный вариант метода прямого микроскопирования молока для подсчета соматических клеток может быть при необходимости использован как прямой контрольный метод в условиях производственных лабораторий и включен в проект межгосударственного стандарта. Данный метод мы не можем считать арбитражным, так как при его реализации основные риски связаны с субъективными факторами, в частности с квалификацией конкретного исполнителя.
В табл. 2 приведены результаты сравнительных исследований четырех образцов сырого молока на количество соматических клеток, определяемых с помощью прямого метода микроскопирования и косвенных методов: по изменению вязкости на вискозиметре «Соматос-МИНИ» (производитель – ООО ВПК «Сибагроприбор») и флуоресцентной микроскопии с использованием счетчика соматических клеток DCC (фирма DeLaval). Для оценки воспроизводимости результатов каждое определение было проведено дважды.
Приведенные в табл. 2 результаты показывают, что при очень низком уровне содержания в молоке соматических клеток в данной серии опытов разброс данных значителен, однако укладывается в допустимую ошибку повторяемости 12 %. С увеличением в пробах количества соматических клеток результаты измерений, получаемые различными методами, сближаются. При содержании в молоке соматических клеток порядка 106/см3 метод прямого микроскопирования дает более высокие значения, чем косвенные методы контроля.
Проводя сравнительную оценку методов определения количества соматических клеток, можно утверждать, что показатели, получаемые при оценке одних и тех же проб молока, зависят как от используемого метода, так и от уровня содержания соматических клеток в молоке. По результатам проведенной работы разработан проект стандарта на методы контроля соматических клеток в молоке сыром по изменению вязкости, флуоресцентной микроскопией и на модифицированный контрольный метод – прямой подсчет соматических клеток путем микроскопирования. Проект стандарта включен в программу международной стандартизации на 2013 г. Разработчик стандарта – ВНИИМС.
С полными текстами всех статей
вы можете ознакомиться
на страницах журнала
источник
Для исследования готовят 5-процентный раствор димастина на дистиллированной или прокипяченной теплой воде. В каждое углубление пластинки из соответствующей четверти вымени надаивают по 1 мл молока и добавляют 1 мл приготовленного раствора димастина из бутылки с пипеткой-автоматом. Смесь молока с реактивом перемешивают палочкой в каждой лунке поочередно в течение 10 — 15 секунд. При использовании пластинки МКП-2 палочка не требуется, смешивание молока с реактивом производится путем горизонтального вращения пластинки одновременно во всех лунках. Реакция учитывается по густоте желе и изменению цвета. Учет реакции по вязкости желе: — отрицательная реакция — однородная жидкость (-); — сомнительная реакция — следы образования желе (+/-); — положительная реакция — ясно видимый сгусток (от слабого до плотного), который можно выбросить из луночки палочкой при перемешивании (+). На пластинке МКП-2 при отрицательной реакции (-) образуется однородная смесь. Сомнительная реакция (+/-) — во время вращения пластинки на дне лунки заметны тонкие хлопья без тенденции образования сгустка. Положительная реакция (+) — отчетливое появление слабого или быстро образующего плотного сгустка, концентрирующегося при вращении в центре луночки. Определение pH по цвету: — оранжевый, оранжево-красный (красно-оранжевый) — нормальная реакция молока (pH 6,5 — 6,8); — желтый — повышение кислотности молока (pH 6,8); — алый, пунцовый, малиновый — ярко выраженная щелочность (pH > 7,0).
Проба с 10-процентным раствором мастидина.
Для исследования коров на мастит по молоку из удоя применяют 10-процентный раствор мастидина. В случае невозможности постановки реакции на мастит сразу после взятия пробы молока можно консервировать 2-процентным раствором бихроматокалия (из расчета 1 мл консерванта на 100 мл молока) или перекисью водорода (1 — 3 капли 30 — 33-процентного р-ра на 100 мл молока). Техника постановки пробы на пластинках МКП-1 и МКП-2 и учет результатов реакции по образованию желе проводят, как указано в п. 3.3.1. Определение pH по цвету: — светло-сиреневый, дымчатый — pH молока в норме (6,5 — 6,8); — почти белый — повышенная кислотность молока; — темно-сиреневый — повышенная щелочность молока. Для определения пораженной четверти вымени от животных, давших положительную и сомнительную реакцию с 10-процентным раствором мастидина, отбирают пробы молока из каждой четверти и исследуют с 5-процентным или 2-процентным растворами мастидина и по пробе отстаивания.
Проба с 2-процентным раствором мастидина.
Для приготовления 2-процентного раствора мастидина к 100 мл 10-процентного раствора прибавляют 400 мл дистиллированной или заранее приготовленной прокипяченной теплой воды. Постановка пробы и учет реакции проводят по образованию сгустка и изменению цвета, как при исследовании молока с 10-процентным раствором мастидина (п. 3.3.2). Образование сгустка является основным диагностическим признаком при исследовании молока по димастиновой и мастидиновой пробам, а изменение цвета является ориентирующим признаком. Показания быстрых диагностических тестов с димастином или мастидином не имеют самостоятельного значения для постановки диагноза на мастит, они в обязательном порядке должны подтверждаться пробой отстаивания .
Проводится путем отбора секрета из четвертей вымени, которые реагировали положительно на димастиновый или мастидиновый тесты. В конце доения коровы надаивают в пробирку 10 мл молока (секрета) и ставят ее на 16 — 18 часов в холодильник или в другое холодное место, чтобы за время отстоя молоко не прокисло. На второй день пробы просматривают и учитывают результат. Лучше учет проводить при дневном свете. При этом обращают внимание на наличие осадка, количество и характер сливок и цвет молока. Молоко здоровых коров имеет белый или слегка синеватый оттенок, осадка не образует. Молоко от больных маститом коров водянистое, изменяется консистенция сливок, они становятся тягучими, слизистыми, хлопьевидными. Основным диагностическим признаком при учете результатов пробы отстаивания является осадок. Образование его в отстоявшемся молоке или наличие хлопьевидных, тягучих слизистых сливок указывает на положительный результат пробы отстаивания. Корову с таким молоком считают больной маститом, ее изолируют от общего стада и подвергают лечению. Молоко из пораженной маститом четверти выдаивают руками, собирают отдельно и уничтожают. Молоко из непораженных четвертей в каждом отдельном случае бракуют в соответствии с наставлением по применению того или иного метода лечения.В Учхозе «Пригородное» имеется бойня, соответствующая ветеринарно-санитарным требованиям. Ветеринарные врачи отделений также осуществляют контроль за соблюдением технологии доения, первичной обработки молока. Также они следят за чистотой молочного оборудования и посуды, за соблюдением личной гигиены работниками животноводства. Все доярки, телятницы и скотники обеспечены спецодеждой.
На молоко выдается сертификат соответствия на один год, имеющий юридическую силу на территории России. Кроме того хозяйству ежегодно выдается ветеринарное регистрационное удостоверение на право выращивания, разведение, переработки и реализации животноводства (молока, мяса, шкур крупного рогатого скота).
источник
Методы определения соматических клеток
Milk. Methods for determination of somatic cells
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом маслоделия и сыроделия Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 46-2014 от 05 декабря 2014 г.)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 08 декабря 2014 г. N 1950-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 23453-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 января 2016 г.
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 11, 2015 год
Поправка внесена изготовителем базы данных
Настоящий стандарт распространяется на сырое молоко и устанавливает методы определения соматических клеток.
Стандарт не распространяется на термически обработанное, фальсифицированное химическими агентами (мочевина, перекись водорода, формалин и д.р.) и подмороженное молоко, а также на сырое молоко титруемой кислотностью более 21°Т.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 745-2003 Фольга алюминиевая для упаковки. Технические условия
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4234-77 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия
ГОСТ 5262-67* Спирт этиловый ректификованный. Технические условия
_______________
* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 5962-67, здесь и далее по тексту. — Примечание изготовителя базы данных.
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 11773-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 23455-79 Препарат «Мастоприм». Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, отбор проб и подготовка их к анализу. Часть 1. Молоко, молочные и молочные составные, молокосодержащие продукты
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
В настоящем стандарте применены термины по [1], а также следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 соматические клетки : Клетки, составляющие тело (сому) многоклеточных организмов и не принимающие участия в половом размножении (все клетки животного или растения за исключением половых клеток (гамет)).
3.2 флуоресцентная микроскопия : Метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбужденных атомов и молекул образца после его облучения светом с большей частотой. Излучение образца пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флуоресцентного препарата в оптическом спектре фиксируется специальной цифровой камерой.
4.1 Отбор проб и подготовка их к испытанию — по ГОСТ 26809.1.
5.1 Сущность метода
Метод основан на воздействии сульфанола (поверхностно-активного вещества, входящего в состав препарата «Мастоприм») на клеточную оболочку соматических клеток, приводящем к нарушению ее целостности и выходу содержимого клеток во внешнюю среду. При этом изменяется вязкость (консистенция) сырого молока, что оценивают визуально.
5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ±0,1 г.
Колбы мерные 1(2, 3, 4)-100-2 по ГОСТ 1770.
Пипетки 2(3)-1 -1 по ГОСТ 29169.
Пластинки молочно-контрольные ПМК-1 и ПМК-2.
Термометр стеклянный жидкостной (нертутный) по ГОСТ 28498 диапазоном измерения от 0°С до 100°С и ценой деления шкалы 1°С.
Стаканы 1 (2)-50 по ГОСТ 25336.
Палочки стеклянные или пластмассовые с оплавленным концом диаметром не более 5 мм.
Плитка электрическая по ГОСТ 14919.
Секундомер механический или цифровой ценой деления 0,2 с.
Препарат «Мастоприм» по ГОСТ 23455.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Вода питьевая по нормативным и техническим документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
5.3.1 Приготовление кипяченой питьевой воды
Питьевую воду кипятят в течение 5-10 мин, охлаждают до температуры 30°С-35°С и используют для приготовления раствора препарата «Мастоприм».
5.3.2 Приготовление раствора препарата «Мастоприм»
2,5 г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доливают до метки дистиллированной или кипяченой питьевой водой температурой 30°С-35°С. Раствор должен быть прозрачным белого цвета. Допускается помутнение и образование незначительного осадка, который растворяется при нагреве до температуры 30°С-35°С. Раствор перед применением перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре хранения 10°С-30°С — не более 1 сут.
5.4 Проведение анализа
От тщательно перемешенной пробы анализируемого сырого молока пипеткой отбирают 1 см , помещают в луночку пластинки ПМК-1 и добавляют 1 см раствора препарата «Мастоприм».
Сырое молоко с раствором препарата «Мастоприм» интенсивно перемешивают стеклянной или пластмассовой палочкой в течение 10 с. Не прекращая интенсивного перемешивания смеси в луночке, поднимают палочку вверх на 5-7 см и визуально оценивают изменение вязкости смеси. Наблюдение ведут не более 60 с.
5.5 Обработка результатов
Количество соматических клеток в анализируемом сыром молоке устанавливают визуально по изменению вязкости (консистенции) смеси сырого молока с препаратом «Мастоприм» в соответствии с требованиями таблицы 1.
Таблица 1
Характеристика вязкости (консистенции) смеси
Однородная жидкость или слабый сгусток, который слегка тянется за палочкой
От сгустка, тянущегося за палочкой в виде нити, до выраженного сгустка, при перемешивании которого хорошо видна выемка на дне луночки пластинки. Сгусток не выбрасывается палочкой из луночки пластинки
Плотный сгусток, который выбрасывается палочкой из луночки пластинки
* Нижний предел точности визуального метода — 500 тыс. соматических клеток в 1 см сырого молока, что соответствует международно признанной границе физиологической нормы и говорит об отсутствии или незначительной примеси (до 6%) маститного молока в сборном. Для определения в сыром молоке меньшего количества соматических клеток и получения конкретных числовых значений необходимо применять инструментальные методы.
6.1 Сущность метода
Метод основан на воздействии сульфанола (поверхностно-активного вещества, входящего в состав препарата «Мастоприм») на клеточную оболочку соматических клеток, приводящем к нарушению ее целостности и выходу содержимого клеток во внешнюю среду. При этом изменяется вязкость (консистенция), что оценивают вискозиметром.
6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIMLR 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ±0,1 г.
Вискозиметр капиллярного типа, откалиброванный производителем прибора на определение количества соматических клеток в сыром молоке, с диаметром капилляра рабочего сосуда (1,50±0,05) мм и длиной капилляра (1,00±0,05) мм.
Колбы мерные 1(2, 3, 4)-100-2 по ГОСТ 1770.
Пипетки 2(3)-1-5(10) по ГОСТ 29169.
Термометр стеклянный жидкостной (нертутный) по ГОСТ 28498 диапазоном измерения от 0°С до 100°С и ценой деления шкалы 1°С.
Секундомер электронный, тип СТЦ-2.
Стаканы 1(2)-50 по ГОСТ 25336.
Палочки стеклянные или пластмассовые с оплавленным концом диаметром не более 5 мм.
Плитка электрическая по ГОСТ 14919.
Препарат «Мастоприм» по ГОСТ 23455.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Вода питьевая по нормативным и техническим документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
6.3.1 Приготовление кипяченой питьевой воды
Питьевую воду кипятят в течение 5-10 мин, охлаждают до температуры 30°С-35°С и используют для приготовления раствора препарата «Мастоприм».
6.3.2 Приготовление раствора препарата «Мастоприм»
3,5 г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доливают до метки дистиллированной или кипяченой питьевой водой при температуре 30°С-35°С. Раствор должен быть прозрачным белого цвета. Допускается помутнение и образование незначительного осадка, который растворяется при нагреве до температуры 30°С-35°С. Раствор перед применением перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре хранения 10°С-30°С — не более 1 сут.
6.3.3 Подготовка пробы сырого молока для анализа
Перед проведением анализа устанавливают температуру сырого молока в пределах от 18°С до 22°С.
5 см раствора препарата «Мастоприм» и 10 см анализируемого сырого молока отбирают пипетками и вносят в сосуд вискозиметра. Анализируемое сырое молоко перед отбором пробы необходимо тщательно перемешать и при необходимости очистить от механических примесей.
Смесь анализируемого сырого молока с раствором препарата «Мастоприм» в сосуде вискозиметра перемешивают в течение (30±10) с в ручном или автоматическом режиме. По окончании перемешивания определяют количество соматических клеток в анализируемом сыром молоке по времени вытекания смеси из капилляра. Продолжительность вытекания определяется вязкостью смеси сырого молока с раствором препарата «Мастоприм», которая коррелирует с исходным содержанием в нем соматических клеток.
Диапазон определения количества соматических клеток при использовании капиллярных вискозиметров составляет от 90 до 1500 тыс. в 1 см сырого молока и продолжительность вытекания смеси из капилляра колеблется от 12 до 58 с, что указано в таблице 2.
Таблица 2
Продолжительность вытекания*, с
* Продолжительность вытекания смеси из капилляра вискозиметра диаметром капилляра рабочего сосуда (1,50±0,05) мм и длиной капилляра (1,00±0,05) мм.
После проведения анализа смеси для каждой анализируемой пробы сырого молока сосуд прибора следует подготовить для проведения следующего анализа согласно процедуре, описанной в инструкции по применению прибора.
6.5 Обработка результатов
За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать:
Предел допускаемой погрешности результатов измерений составляет 10% в интервале доверительной вероятности Р =0,95.
7 Метод контроля соматических клеток флуоресцентной микроскопией с использованием анализатора соматических клеток DCC
7.1 Сущность метода
Метод основан на разрушении цитоплазматической мембраны соматических клеток под действием лизогенного буфера. При этом ядра клеток становятся доступными для действия флуоресцентного красителя, в качестве которого используется йодид пропидия. Йодид пропидия связывается с двухспиральной ДНК соматических клеток, и образует флуоресцентное вещество, поглощающее зеленый свет и излучающее красный, идентифицирующее клетки. Система дает изображение клеток, а встроенный в анализатор компьютер с помощью программного обеспечения подсчитывает количество белых точек, что соответствует количеству соматических клеток.
7.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы
Анализатор клеток DCC, работающий на принципе флуоресцентной микроскопии, оснащенный приемным устройством для кассеты (съемная оправка), жидкокристаллическим дисплеем с подсветкой, в комплекте с кассетами (Nucleo-кассета), флаконами для проб.
Nudeo-кассета, откалиброванная по объему, состоящая из поршня, проточной системы с флуоресцентным красителем йодидом пропидия и измерительной камеры.
Проверочная кассета с определенным фиксированным количеством имитаторов соматических клеток.
Термометр стеклянный жидкостной (нертутный) по ГОСТ 28498, диапазоном измерения от 0°С до 100°С и ценой деления шкалы 1°С.
Флакон для проб.
Стаканы 1(2)-50 по ГОСТ 25336.
Палочки стеклянные или пластмассовые с оплавленным концом диаметром не более 5 мм.
Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения.
7.3 Подготовка к проведению измерений
Тестирование анализатора DCC и партии кассет проводят в соответствии с приложением А.
7.4 Проведение измерений
Аккуратно перемешивают пробу сырого молока во флаконе для проб или стеклянном стакане при помощи стеклянной палочки, не допуская вспенивания. Температура пробы молока должна быть в диапазоне от 10°С до 40°С.
Вскрывают пакет с Nucleo-кассетой и вынимают ее для проведения измерений. Nucleo-кассета не должна находиться на свету более 3 мин.
Набирают сырое молоко в Nucleo-кассету, опуская всасывающее устройство кассеты во флакон с пробой сырого молока и нажимая на поршень. Сырое молоко должно дойти до половины дорожки 3.
Помещают кассету в счетчик так, чтобы всасывающее устройство располагалось слева, после чего закрывают крышку отсека для кассеты.
Проводят измерение в режиме «Run».
Через 1 мин фиксируют результат, отображенный на дисплее прибора.
7.6 Контроль точности результатов измерений
7.6.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости
Разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в различных лабораториях, различными операторами с использованием различного оборудования, при уровне доверительной вероятности Р =0,95 не должна превышать 15%.
8.1 Сущность метода
Метод основан на высушивании распределенной на предметном стекле анализируемой пробы сырого молока с последующим окрашиванием мазка и подсчете с использованием микроскопа количества окрашенных соматических клеток на установленной площади.
8.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ±0,2 мг.
Бани водяные с терморегулятором, позволяющим поддерживать температуру (40±2)°С, (50±2)°С, (65±2)°С.
Микроскоп световой биологический с увеличение от 500 до 1000 . Допускается использовать масляно-иммерсионные объективы.
Термометр стеклянный жидкостной (нертутный) по ГОСТ 28498, диапазоном измерения от 0°С до 100°С и ценой деления шкалы 1°С.
pH-метры или иономеры, имеющие следующие технические и метрологические характеристики: диапазон измерений от 0 до 12 (14) ед. pH, ручную и/или автоматическую термокомпенсацию, пределы допускаемого значения основной (абсолютной) погрешности преобразователя не более ±0,02 ед. рН.
Микрошприц типа МШ-10, для дозирования установленного объема молока 0,01 см , с максимальной погрешностью ±2%.
Стекла предметные, с предварительно нанесенным очерченными прямоугольными контурами, площадью от 95 до 105 мм или стандартное предметное стекло размером 20х5 мм или стекла с шаблоном.
Стеклянные емкости с плотно притертыми крышками для хранения растворов красителя.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Фольга алюминиевая по ГОСТ 745.
Чашки Петри ЧБН-1-100 или ЧБН-2 по ГОСТ 25336.
Колба коническая Кн-2-250 ТС по ГОСТ 25336.
Пинцет.
Спиртовка СЛ-1 по ГОСТ 25336.
Цилиндры 1(2)-50(100)-1 по ГОСТ 1770.
Ксилол, массовой долей основного вещества не менее 99,5%.
Метиленовый синий, индикатор.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5262 и спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.
Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч. или ледяная.
Хлорид натрия по ГОСТ 4233, х.ч. или ч.д.а.
Калий хлористый по ГОСТ 4234, х.ч. или ч.д.а.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 7-водный по ГОСТ 11773, ч.д.а.
Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч. или ч.д.а.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или деминерализованная.
Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
8.3.1 Приготовление окрашивающего раствора
В конической колбе вместимостью 250 см смешивают 54,0 см этанола объемной долей 95% и 40,0 см ксилола, колбу закрывают алюминиевой фольгой. Смесь нагревают на водяной бане до температуры (65±1)°С. В вытяжном шкафу в смесь добавляют 0,6 г метиленового синего и тщательно перемешивают. Смесь охлаждают до температуры (4±1)°С.
Затем добавляют 6,0 см ледяной уксусной кислоты и вновь тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр и помещают в герметичный сосуд на хранение.
8.3.2 Приготовление фосфатного буферного раствора
В мерной колбе вместимостью 1000 см в деминерализованной воде растворяют 8,0 г хлористого натрия, 0,2 г хлористого калия, 1,15 г двузамещенного фосфата натрия и 0,2 г однозамещенного фосфата калия. Доводят объем метки деминерализованной водой.
Устанавливают активную кислотность раствора на уровне (7,2±0,1) ед. pH.
Примечание — Допускается использовать готовый буферный раствор с активной кислотностью, равной 7,2 ед. pH.
8.3.3 Приготовление анализируемой пробы
До проведения определения анализируемые пробы сырого молока хранят при температуре (4±2)°С. Определение проводят в течение 6 ч после отбора проб.
100 см анализируемой пробы сырого молока нагревают на водяной бане до температуры 40°С, постоянно перемешивая, охлаждают до температуры 20°С.
Разбавляют анализируемую пробу фосфатно-буферным раствором до получения соматических клеток на уровне 500 тыс. клеток/см .
Для каждой разбавленной пробы рассчитывают коэффициент разбавления по формуле
где d — коэффициент разбавления для получения надлежащего количества соматических клеток в анализируемой пробе, примерно 500 тыс. клеток/см ;
— объем анализируемой пробы, см ;
— объем буферного раствора, используемого для разбавления анализируемой пробы, см .
Записывают коэффициент разбавления d , объем анализируемой пробы и объем буферного раствора , используемый для получения нужного разбавления.
8.4 Проведение анализа
Для каждой анализируемой пробы готовят не менее двух мазков и отбирают стандартный.
8.4.1 Приготовление мазка
Перед приготовлением мазка предметное стекло необходимо обезжирить и простерилизовать. Для этого предметное стекло погружают в 95%-ный раствор этанола и стерилизуют пламенем, после чего охлаждают.
Используя микрошприц, отбирают 0,01 см анализируемой пробы (при необходимости разбавленной). Микрошприц промывают анализируемой пробой. При необходимости тщательно и аккуратно очищают внешнюю сторону микрошприца, которая контактировала с анализируемой пробой.
Смесь помещают на чистое предметное стекло площадью 1 см . Используя иглу, равномерно распределяют анализируемую пробу на всей указанной поверхности, при этом контролируют, чтобы площадь, прилегающая к внешним границам, была также равномерно покрыта. Мазок подсушивают при комнатной температуре до состояния полной сухости.
Высушенный на предметном стекле мазок погружают в окрашивающий раствор метилового синего и выдерживают в нем в течение 15-30 мин. Высушивают мазок при комнатной температуре.
Затем осторожно смывают излишки красителя в стакане с водопроводной водой. Высушивают вновь и хранят в условиях защиты от пыли.
Срок хранения предметных стекол с мазками — не более 12 мес.
8.4.2 Подсчет соматических клеток
8.4.2.1 Общие положения
Используя микроскоп, подсчитывают соматические клетки в полученном мазке по 8.4.1 в полях микроскопа, целиком заполненных мазком молока. Выбирают наилучшее увеличение (от 500 до 1000 ).
Подсчету подлежат соматические клетки, к числу которых относятся: макрофаги (размер клеток 8-30 мкм), полиморфоядерные нейтрофилы (размер клеток 10-14 мкм), лимфоциты (размер клеток 5-10 мкм), лейкоциты (размер клеток 5-10 мкм) и эпителиальные клетки (размер клеток 10-14 мкм). Количество соматических клеток подсчитывается в целом, поэтому нет необходимости дифференцировать их между собой.
Примечания
1 Лаборант должен уметь отличать соматические клетки от бактериальных, а также клеток дрожжей, плесневых грибов и от жировых шариков.
2 Под микроскопом бактериальные клетки, не зависимо от формы, имеют значительно меньший размера, чем соматические. Их размер колеблется от 0,3 до 4-5 мкм.
3 Дрожжи имеют клетки круглой, овальной или продолговатой формы, часто почкующиеся, с выраженным ядром или без него, зерненные или нет, размером 2,5-10х2,5-30 мкм. Соматические клетки труднее всего дифференцировать от клеток дрожжей, однако, они в среднем более крупные и в препаратах имеют неровный и менее прокрашенный край.
4 Споры плесневых грибов размером с бактериальную клетку и имеют круглую, овальную или яйцевидную форму. Гифы (вегетативные тела) обычно крупные 5-50 мкм, однако имеют характерную палочковидную форму с перегородками или без них и хорошо отличаются от соматических клеток.
5 Жировые шарика имеют окрашенные контуры и слабую окраску внутри, крупных размеров и создают фон, на котором просматриваются соматические и бактериальные клетки.
Не следует подсчитывать клетки с размером менее 8 мкм. Фрагменты клеток подсчитывают как одну клетку, если ядра четко не разделены.
8.4.2.2 Подсчет в последовательных полях микроскопа
Подсчитывают соматические клетки в последовательных полях, в вертикальных полосах на равномерно размещенных полях.
Подсчет начинают приблизительно на расстоянии d =0,5 мм от левой стороны.
Помещают нижний (верхний) край окружности поля микроскопа к внутренней нижней (верхней) границе мазка.
После подсчета первого поля объектив передвигают на установленное расстояние d вверх или вниз до следующей градации и подсчитывают новое поле. Расстояние d =1 мм считается пригодным.
Так повторяют вплоть до достижения противоположной стороны полосы.
Выбирают один из двух приведенных вариантов:
— последнее поле не подлежит подсчету;
— подсчет проводится после передвижения объектива до полного исчезновения границы мазка с поля, если появляется верхняя или нижняя граница мазка и она заполняет менее половины поверхности поля.
Затем объектив передвигают вправо на расстояние d =1,5 мм или d =2 мм в зависимости от необходимого числа полей и начинают работать с новой полосой в противоположном направлении. Операции повторяют до достижения правой стороны шаблона.
(Поправка. ИУС N 11-2015).
Результат определяют в соответствии с формулой (2).
Примечание — В случае прямоугольной формы возможно расположение 5 полей на 1 мм в вертикальных полосах и 10 полос, расположенных на расстоянии 2 мм, что позволяет подсчитать 50 полей.
8.4.2.3 Подсчет в прямоугольной форме по полосам
Соматические клетки подсчитывают в расположенных с равными интервалами вертикальных полосах.
Подсчет начинают приблизительно на расстоянии d от левой стороны. Расстояние d =0,5 мм считается пригодным.
Начинают подсчитывать от верхней или нижней границы прямоугольной площади. Помещают границу поверхности в центр зрения микроскопа. После подсчета всех клеток объектив передвигают в направлении, противоположном границе, и подсчитывают все клетки, видимые в этой полосе, вплоть до достижения противоположной границы. Записывают число подсчитанных клеток.
Затем объектив передвигают вправо на расстояние d и начинают подсчет новой полосы (например, d =3-4 мм в зависимости от необходимого числа полей для репрезентативного подсчета всего мазка).
Операции повторяют до достижения правой стороны шаблона.
Результат подсчитывают, как указано в 8.5.
8.5.1 Подсчет для прямоугольной формы в последовательных полях
Проверяют контрольные значения 20,0 и 5,0 мм для длины L и ширины W мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа.
Рассчитывают общую концентрацию клеток, используя следующее уравнение
N — общее количество подсчитанных клеток, шт.;
D — диаметр поля микроскопа, мм;
N — количество полностью подсчитанных полей, шт.;
V — объем испытуемой пробы мазка, равный 0,01 см
d — коэффициент разбавления, используемый в 6.3.3.
8.5.2 Подсчет для прямоугольной формы в полосах
Проверяют контрольные значения 20,0 и 5,0 мм для длины и ширины мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа.
Рассчитывают общую концентрацию с клеток, используя следующее уравнение
где N — количество полностью подсчитанных полос.
Остальные обозначения приведены в 8.5.1
8.6 Прецизионность
Точность настоящего метода установлена с учетом требований нормативных документов, действующих на территории государств, принявших стандарт*.
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
Значения, полученные для повторяемости и воспроизводимости, выражены при уровне вероятности Р =95%.
8.6.1 Повторяемость
Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5% случаев превышать значения, приведенные в таблице 3.
Таблица 3 — Значения повторяемости
источник