Антитела при лечении рака груди

Система иммунитета является универсальным способом реагирования организма на чужеродные вещества и микроорганизмы. Они могут попасть к человеку извне, а могут быть своими собственными клетками, которые в результате неправильного деления приобрели новые свойства, способность оставаться в недифференцированном состоянии и защиту от естественного апоптоза.

Но иногда эта система не срабатывает, и в организме развивается опухоль. Если найти способ подстегнуть иммунитет, то можно победить рак. Иммунотерапия при раке груди является одним из прогрессивных направлений медицины, которое уже дает положительные результаты.

Первые попытки использования стимулирования иммунитета для лечения рака были предприняты в 19 веке. В 1891 году американский врач Уильям Коли, еще не имея точных сведений о работе иммунной системы, заметил, что у больных саркомой, которые перенесли стрептококковую инфекцию, появляется одна закономерность: постепенно размер опухоли уменьшается, а их состояние улучшается. Тогда он попробовал создать первую противораковую вакцину на основе ослабленных возбудителей скарлатины и рожи. Они были не способны вызвать воспаление, но стимулировали иммунитет. Метод оказался эффективен, но был подвергнут критике как опасный.

Лишь развитие иммунологии в середине 20 века позволило вновь вернуться к поиску противораковой вакцины. Открытие интерлейкинов, факторов роста, интерферона позволило целенаправленно искать способ победить рак. Но тогда вакцины создавались путем иммунизации животных.

Развитие генетики к концу 20 века привело к открытию генов, которые кодируют злокачественный рост опухоли. Это открыло новые способы лечения онкологии, а также позволило создавать вакцины не при помощи лабораторных животных, а методом генной инженерии.

В настоящее время основу лечения рака составляет комбинированная терапия. Это значит, что проводится многоэтапное лечение, которое включает:

p, blockquote 8,0,0,0,0 —>

хирургическое удаление опухоли;
химиотерапию;
лучевую терапию.

Последние два способа используются для уничтожения возможных оставшихся раковых клеток и метастазов и профилактики рецидива.

Но такое лечение очень тяжело переносится. Химиотерапевтические препараты и облучение действуют не избирательно. Наравне с раковыми клетками, уничтожаются наиболее чувствительные клетки крови, эпителия, которые обеспечивают защиту организма. Поэтому после химиотерапии легко возникает кандидоз, любые инфекционные патологии, а сам пациент становится истощенным, теряет волосы, получает анемию и проблемы с пищеварением.

Иммунотерапия лишена таких недостатков. С ее помощью происходит точное воздействие только на раковые клетки, которые отличаются по антигенной структуре от здоровых. Поэтому нет таких выраженных побочных эффектов.

При раке молочной железы иммунотерапия основывается на общих принципах лечения онкологических заболеваний этим способом. Препараты, которые при этом используются, можно отнести к трем группам:

p, blockquote 12,0,0,0,0 —>

Специфические противораковые вакцины. Их действие направлено на определенные раковые клетки, к антигенам которых формируется специфический иммунитет. Защита может быть создана и против онкогенных вирусов, которые способны проникнуть в организм.
Неспецифические иммуностимуляторы приводят к усилению выработки клеток миелоидного ряда. Они не действуют против конкретной опухоли или возбудителя, а помогают иммунитету настроиться на борьбу. Это такие препараты, как Тимоген, Декарис, Реаферон, Пролейкин, настойка элеутерококка.
Моноклональные антитела – это группа белков, которые вырабатываются одной плазматической клеткой-клоном, особой разновидностью В-лимфоцита. Это способ точечно воздействовать на конкретный тип опухоли.

Для лечения онкозаболеваний молочной железы могут использоваться все перечисленные типы препаратов. Но эффективность достоверно подтверждена только у трех препаратов моноклональных антител. Остальные варианты проходят клинические испытания.

Тип вакцины определяется способом ее получения и механизмом действия. На данный момент существует два вида вакцин:

p, blockquote 15,0,0,0,0 —>

Клеточные – в их состав входят сами раковые клетки. Они могут быть от самого пациента – это аутологичная вакцина. Если берутся клетки от такого же вида раковой опухоли, но у другого больного – это аллогенные препараты.
Антигенные – в состав входят только белки-антигены конкретного вида рака.

Клеточные вакцины не могут «заразить» раком. Клетки, которые входят в их состав, обработаны специальным образом и ослаблены. К ним организм заболевшего начинает вырабатывать собственные антитела, которые подавляют одновременно рост имеющейся опухоли.

Антигеном для соответствующего типа вакцины могут выступать частицы раковых клеток, их белки, генетический материал. Для доставки в организм больного могут применяться вирусы-переносчики, которые также сами не вызывают болезнь, а лишь транспортируют антигены к месту назначения.

Также вакцина может быть моновалентной и действовать против одного вида рака, или поливалентной, которая помогает побеждать несколько видов опухоли.

Наиболее известными являются следующие виды вакцин:

p, blockquote 19,0,0,0,0 —>

Oncophage (Витеспен);
Onyvax;
Cancer-Vax;
NY-ESO-1;
ALVAC-CEA;
VG-1000;
TRICOM;
Prostvac.

Это не полный список, ученые постоянно разрабатывают новые виды вакцин, некоторые из которых в данный момент проходят клинические испытания.

Неспецифическая иммунотерапия при любом виде рака, в том числе и молочной железы, может проводиться адьювантами. Ее не используют в качестве монотерапии, а лишь как дополнение к основному лечению. Адьюванты оказывают общее стимулирующее действие на всю иммунную систему. Врачи назначают следующие типы препаратов:

p, blockquote 21,0,0,0,0 —>

Иммуномодуляторы – Талидомид, Ревлимид, Ромалист.
Цитокины – Интерлейкин-2, Интерферон-альфа, Колониестимулирующий фактор, Сарграмостин.

Какой препарат лучше в конкретной ситуации решает врач. Единого рецепта для всех не существует.

Открытие, а также возможность получить такие вещества позволило совершить революцию в лечении онкозаболеваний. Моноклональные антитела представляют собой иммунные белки, которые синтезируются клеткой-клоном лейкоцита. Они обладают строго направленным действием и не могут поражать здоровые клетки.

Антитела могут быть двух типов:

p, blockquote 25,0,0,0,0 —>

Неконъюгированные – способны самостоятельно воздействовать на раковые клетки и помечать их для иммунной системы.
Конъюгированные, или таргетного действия. Они помечены химиопрепаратом или радиационным изотопом. Поэтому сочетают в себе радио + иммунотерапию или химио + иммунотерапию.

Моноклональные антитела не только помечают опухолевые клетки, но и сами нарушают в них работу ферментов, блокируют факторы роста и не позволяют образовываться сосудам, питающим ткани опухоли.

Исследования в области моноклональных антител ведутся наиболее активно. Есть попытки создания поливалентных антител, а также с селеном, которые повышают эффективность лечения.

Среди женской онкологии рак груди занимает лидирующее место. На его долю приходится до 12% от всех случаев опухолей. По данным ВОЗ, в последние несколько лет наметилась тенденция уменьшения заболеваемости и смертности от РМЖ в наиболее развитых европейских странах: Великобритании, Швеции, Германии, Финляндии, Франции. В Восточной Европе такая тенденция отсутствует: здесь по-прежнему рак часто выявляется на последней стадии, когда лечение не способно привести к длительной ремиссии или полному излечению.

Долгое время основу лечения составляло хирургическое удаление молочной железы с окружающими лимфоузлами, в объеме, зависящем от распространенности и стадии процесса. Операция обязательно дополнялась радиотерапией, химией и антигормональными средствами. Но использование иммунотерапии позволило улучшить показатели излечения.

Раковые клетки при РМЖ происходят из здоровых собственных клеток, но более молодых. Они по антигенной структуре мало отличаются от нормальной ткани, поэтому иммунная система не получает сигнала к реагированию. Однако некоторые отличия есть. Патологические клетки вырабатываю белки, которые нетипичны для организма. Иммунная система способна на них реагировать, но у каждого человека это происходит с разной скорость. Поэтому у некоторых женщин рак быстро прогрессирует, а у других долго находится в начальной стадии.

Особенностью онкопатологий молочной железы является способность атипичных клеток уходить от иммунного ответа. Это происходит несколькими путями. Опухолевые ткани способны синтезировать разные типы белков, часто менять антигенную структуру. Это не позволяет системе иммунитета быстро распознать заболевание. Другой способ ускользания – это быстрое размножение. Деление в опухолях происходит значительно быстрее за счет того, что клетки не дозревают до полноценного состояния, а начинают делиться в еще не полностью дифференцированном виде.

Долгое время считалось, что рак молочной железы иммунно неактивен. Но позже были найдены способы повлиять на него через иммунотерапию. Существует два ее вида:

p, blockquote 32,0,0,0,0 —>

Активная – из раковых тканей выделяются антигены, которые являются характерными только для них и могут стать мишенью для атаки иммунитета. Затем разрабатывается препарат для этих структур. Примерами такого лечения могут быть противораковые вакцины и Т-клеточная терапия.
Пассивная – введение в организм веществ, которые помогают обнаружить и уничтожить опухоль. К этому типу терапии РМЖ относятся моноклональные антитела, цитокины.

Наиболее авторитетным в сфере фармацевтики является мнение американского Управления по санитарному надзору за качеством продуктов и медикаментов (FDA) и международной некоммерческой организации Кокрейн (Cochrein), а также рекомендации ВОЗ. Признанные препараты для проведения иммунотерапии при раке молочной железы следующие:

p, blockquote 33,0,0,0,0 —>

Трастузумаб (Герцептин);
Пертузумаб (Перьета);
Трастузумаб эмтаназин (Кадсила).

Все они относятся к группе моноклональных антител.

Такое лечение возможно только при HER2-позитивном раке. При таком варианте на поверхности опухолевых клеток присутствуют специфичные белки-рецепторы HER2. Их активация заставляет раковые клетки делиться. Эти рецепторы наличествуют в 20% случаев заболевания, поэтому применение иммунотерапии ограничено. Положительный молекулярно-генетический анализ открывает ряд преимуществ перед химиотерапией:

p, blockquote 35,0,0,0,0 —>

Воздействие прицельное, только на опухоль, поэтому нет повреждения здоровых тканей.
Иммунопрепараты можно применять длительно, не боясь наращивания токсичности и в комбинации с другими препаратами.
Редкое развитие резистентности к лечению.

У каждого из используемых препаратов есть свои особенности.

Используется при раке молочной железы с метастазами:

p, blockquote 38,0,0,0,0 —>

в качестве монотерапии после проведения курса химиолечения;
в качестве первой линии лечения, если не было до этого химии, при этом используется в комбинации с Паклитакселом;
в постменопаузе при наличии гормональных рецепторов в комбинации с ингибиторами ароматазы.

Побочными действиями препарата являются кардиотоксичность, нейтропения, нарушения со стороны легких. Также побочный эффект может проявиться в виде нарушений психики: тревожности, бессонницы, депрессии.

Герцептин обладает тератогенным и эмбриотоксичным действием. Поэтому лечение препаратом запрещено во время беременности и кормления грудью. Также после окончания курса терапии в течение 6 месяцев необходимо тщательно использовать средства контрацепции и избегать беременности. Кормить грудью также запрещено в течение полугода после лечения. Это связано с тем, что период полно выведения препарата занимает до 25 недель.

При метастатическом раке комбинируется с Доцетакселом, при неметастатическом – с Трастузумабом или химиотерапией.

Противопоказан в следующих случаях:

p, blockquote 43,0,0,0,0 —>

период беременности и лактации;
при застойной сердечной недостаточности, в том числе и в анамнезе;
артериальной гипертензии, которая плохо поддается лечению;
нарушения сердечного ритма;
печеночная недостаточность;
перенесенный инфаркт миокарда.

Период, в течение которого нельзя беременеть, также составляет 6 месяцев, что связано с длительным временем выведения.

Случаи передозировки препарата не зафиксированы. Перьета нельзя смешивать с другими лекарствами в одном растворе.

Как и остальные препараты, представляет собой лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного капельного введения. Струйно и болюсно его вводить нельзя.

Он обладает мутагенными и тератогенными свойствами. Во время его применения существует риск нарушения фертильности. Противопоказания к использованию препарата следующие:

p, blockquote 48,0,0,0,0 —>

индивидуальная непереносимость;
беременность и кормление грудью;
интерстициальная болезнь легких, пневмонит;
узловая генерализованная гиперплазия печени;
застойная сердечная недостаточность;
тяжелая степень почечной недостаточности.

Кадсила выводится из организма более длительно, поэтому после прохождения курса терапии от беременности предохраняются в течение 7 месяцев. О проникновении в грудное молоко сведений не имеется, но для снижения риска, не рекомендуется вскармливание в течение 7 месяцев.

Побочные реакции в большинстве случаев применения иммунотерапии протекают мягко. Тяжесть проявления увеличивается при наличии сопутствующей патологии, особенно со стороны сердца, печени, почек и легких.

В клинических лабораториях проходят испытания другие варианты терапии моноклональными антителами. Это такие препараты, как:

p, blockquote 51,0,0,0,0 —>

Бевацизумаб (Авастатин);
Рамицирумаб (Цирамза);
Вантикумаб;
Препарат LJM716;
CDX-011;
IMMU-132.

Они действуют на другие рецепторы, которые могут отвечать за стимуляцию роста сосудов в опухоли, рост самого новообразования, белка, помогающего приобретению устойчивости к иммунитету и помощников в метастазировании.

Отдельно исследуются онколитические вирусы, которые способны заражать и уничтожать рак, интерлейкин-2 и 7, стимулирующие иммунную систему.

Клиник, где проводят иммунотерапию, в настоящее время достаточно много. Это могут быть российские клиники, а также находящиеся в Израиле, Германии и других странах. Но главным этапом является своевременное выявлении рака. Для этого женщине любого возраста необходимо регулярно посещать гинеколога. При невозможности это сделать, можно самостоятельно пальпаторно обследовать грудь на 3-5 день после менструации. При появлении подозрительных выделений из соска, пятен, выпуклостей, узлов или западания и стянутости ткани на груди, обязательно необходимо показаться врачу. Рак молочной железы – это то заболевание, которое можно выявить своевременно, что улучшит показатели лечения и продолжительность жизни после него.

p, blockquote 55,0,0,0,0 —> p, blockquote 56,0,0,0,1 —>

О других способах лечения рака молочной железы можно узнать из отдельных статей:

источник

Иммунотерапия — метод лечения онкологических заболеваний, который использует ресурсы иммунной системы для уничтожения раковых клеток.

До относительно недавнего времени рак молочной железы считался «иммунологически безмолвным». В настоящее время проведено немало исследований, которые показали, что некоторые виды иммунотерапии могут повысить эффективность лечения рака молочной железы, они имеют некоторые преимущества по сравнению с классической химиотерапией.

На данный момент иммунотерапия рака молочной железы — одно из наиболее активно развивающихся направлений в онкологии. Существует острая потребность в новых эффективных методах лечения, так как рак груди по-прежнему остается актуальной проблемой:

Это один из наиболее часто диагностируемых у женщин типов рака. Он составляет 12% от всех онкологических заболеваний.
Рак молочной железы находится на втором месте среди причин женской смертности от злокачественных опухолей.
В 2012 году насчитывалось 1,7 миллиона новых диагнозов и полмиллиона смертей.
Несмотря на то, что смертность от рака груди снижается, заболеваемость продолжает расти.

Выделяют две большие группы иммунотерапии при онкологических заболеваниях:

Активная иммунотерапия задействует собственные ресурсы иммунной системы. Ученые пытаются найти антигены раковых клеток, которые могли бы стать мишенью для иммунной атаки, затем разрабатывают методы, которые помогли бы «натравить» иммунитет на эти вещества. К этой группе можно отнести противораковые вакцины, T-клеточную терапию.
Пассивная иммунотерапия предусматривает введение в организм факторов иммунной защиты, которые помогают уничтожать раковые клетки. К пассивным методам иммунотерапии можно отнести лечение цитокинами, ингибиторами контрольных точек.

Существуют разные виды иммунотерапии при онкологических заболеваниях:

противораковые вакцины;
иммуномодуляторы;
ингибиторы контрольных точек;
онколитические вирусы;
T-клеточная терапия;
адъювантная иммунотерапия;
моноклональные антитела;
цитокины.

Но далеко не все это реально применяется в клинической практике при раке молочной железы. Многие методы пока проходят клинические испытания.

Злокачественные опухоли молочной железы могут обладать разными молекулярно-генетическими свойствами, и это определяет их восприимчивость к тем или иным методам лечения. На поверхности некоторых клеток увеличено количество белка-рецептора HER2. Его активация заставляет раковые клетки размножаться. Рак груди является HER2-позитивным примерно у каждой пятой пациентки.

В настоящее время американским Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрены для клинического применения три иммунопрепарата (их же относят к таргетным препаратам) из группы моноклональных антител: трастузумаб (герцептин), пертузумаб (перьета), трастузумаб эмтанзин (кадсила). Другие виды иммунотерапии пока проходят клинические испытания.

Моноклональные антитела применяют в случаях, когда рак является HER2-позитивным. Проверить это можно с помощью молекулярно-генетического анализа опухолевой ткани.

Иммунотерапия имеет некоторые преимущества перед химиотерапией:

Она действует более прицельно, не повреждает здоровые клетки, и поэтому вызывает меньше побочных эффектов.
Благодаря тому, что иммунопрепараты более безопасны, их можно вводить в течение длительного времени, применять в комбинациях с другими препаратами, не боясь усиления токсичности.
Иммунная система может использовать в качестве мишеней разные антигены злокачественных опухолей, поэтому во время лечения у пациентов реже развивается резистентность.

Моноклональные антитела при раке груди могут вызывать некоторые побочные эффекты. В большинстве случаев они мягкие, но иногда могут быть серьезными.

У некоторых женщин развивается застойная сердечная недостаточность. В большинстве случаев (но не всегда) она сохраняется в течение короткого времени и проходит после завершения лечения. Риски усиливаются, если ингибиторы контрольных точек применяют вместе с химиопрепаратами, особенно с доксорубицином и эпирубицином. Нарушения со стороны сердца проявляются в виде одышки, отеков на ногах, постоянной сильной усталости.

Пертузумаб может вызывать диарею.

Во время беременности моноклональные антитела опасны для плода, способны привести к его гибели. Поэтому, если есть вероятность, что пациентка беременна, врач не станет назначать данный вид иммунотерапии.

Моноклональные антитела. В настоящее время проводятся клинические испытания еще одного препарата, нацеленного на белок HER2 — маркетуксимаба, а также препаратов, которые смогут атаковать и блокировать другие «мишени»:

Блокаторы VEGF (вещества, которое выделяют раковые клетки, чтобы стимулировать рост новых сосудов): бевацизумаб (авастин), рамицирумаб (цирамза).
Блокаторы Wnt (молекулярного сигнального пути, который способствует росту опухоли): вантиктумаб (OMP-18R5).
Блокаторы HER3 (белка, который помогает опухолевым клеткам приобрести устойчивость к лечению): препарат LJM716.
Блокаторы клеточных белков, которые помогают опухолям метастазировать: препараты CDX-011 и IMMU-132.

Противораковые вакцины действуют по аналогии с вакцинами против инфекций. Они «обучают» иммунную систему атаковать те или иные антигены раковых клеток. В настоящее время проходят клинические испытания нескольких разных вакцин.

Ингибиторы контрольных точек. Иммунная система использует сложные молекулярные механизмы, чтобы сдерживать себя от атаки на здоровые клетки. Этими механизмами могут воспользоваться для «маскировки» раковые клетки. Существуют препараты, которые блокируют контрольные точки — вещества, сдерживающие иммунитет.

T-клеточная терапия. Суть метода состоит в том, что у пациента берут T-лимфоциты и в лабораторных условиях «обучают» их распознавать раковые клетки, обрабатывая некоторыми веществами или при помощи генной инженерии. Затем иммунные клетки возвращают в организм пациента, и они начинают атаковать опухоль. Сейчас проходят испытания разных методов T-клеточной терапии.

Онколитический вирус. Представляет собой генетически модифицированный вирус, который атакует и разрушает раковые клетки.

Адъюванты. Представляют собой химические вещества (чаще всего лиганды), которые связываются с рецепторами на поверхности клеток и усиливают или ослабляют иммунный ответ. Могут применяться отдельно или в сочетании с другими иммунопрепаратами.

Цитокины. Это небольшие информационные молекулы, которые могут стимулировать иммунную систему. В настоящее время при раке молочной железы проходят клинические испытания два препарата из этой группы: интерлейкин-2 и интерлейкин-7.

Стоимость курса иммунотерапии — от 150 тыс. р.

Для подробного расчета получите консультацию врача.

В Европейской клинике доступны наиболее современные химиопрепараты, иммунопрепараты, таргетные препараты для лечения рака груди и других онкологических заболеваний, одобренные на территории России. Мы знаем, как помочь, если рак прогрессирует, если не помогает химиотерапия, которую вам назначили в другой клинике. Мы можем помочь пациентам, которые желают принять участие в клинических испытаниях новых препаратов. Свяжитесь с нами.

источник

Иммунотерапия – это современный метод лечения онкологических заболеваний, который помогает больному бороться с раковыми клетками, создавая собственную вакцину от патологических клеток. Иммунотерапию применяют на разных стадиях развития заболевания, при метастазировании опухоли. Иммунотерапия позволяет значительно снизить дозу химиопрепаратов, снизить токсическое действие препаратов на организм больного. Иммунотерапия при онкологии в Москве проводится в отделении онкологии Юсуповской больницы. В больнице пациент получает все виды помощи, проходит реабилитацию после лечения заболевания.

Иммунотерапия – это новое направление в онкологии, которое до сих пор находится на стадии исследования. Лечение рака иммунотерапией проводится разными видами:

цитокины;
иммуномодуляторы;
онколитические вирусы;
противораковые вакцины;
ингибиторы контрольных точек;
адъювантная иммунотерапия;
Т-клеточная терапия;
моноклональные антитела.

Основные группы препаратов применяются в иммунотерапии в зависимости от вида рака:

интерлейкины – передают информацию о развитии раковых клеток;
моноклональные антитела – обнаруживают и уничтожают раковые клетки;
цитокины – передают информацию между иммунными клетками;
Т-хелперы – иммунные тела высокой активности, применяются для клеточной терапии;
дендритные клетки – смесь клеток-предшественников крови и раковых клеток. Смесь обладает свойством обезвреживать раковые клетки;
TIL-клетки – создаются из клеток опухоли пациента, обладают новыми функциями;
гамма-интерфероны – убивают раковые клетки;
вакцина от рака – получают из клеточного материала злокачественной опухоли. В организме пациента вакцина способствует выработке противоопухолевых антител.

Первые моноклональные антитела были получены в 1975 году. Более тридцати лет усовершенствовалось получение моноклональных антител. Иммунотерапия моноклональными антителами ESK1– инновационный метод, который был разработан в 2010 году, с помощью антител распознаются аномальные клетки и уничтожаются. Моноклональные антитела стали терапевтическим средством для борьбы с раком.

Лечение рака иммунотерапией в Москве проводится в ряде онкологических клиник, больниц с онкологическими отделениями. Иммунотерапия при онкологии в Москве проводится в Европейской, ЕМС, Витамед, Юсуповской больнице и других медицинских учреждениях.

Рак молочной железы развивается в железистой ткани молочной железы. На ранней стадии заболевание не проявляется выраженными симптомами и протекает незаметно. Несвоевременное лечение приводит к метастазированию опухоли в другие органы и ткани. Метастазирование опухоли проходит по лимфатической и кровеносной системе. Метастазы при раке груди поражают надключичные и подмышечные лимфатические узлы, на более поздней, 4 стадии, метастазы опухоли обнаруживают в легких, печени, костной ткани.

Долгое время рак молочной железы считался безответным на иммунологическое лечение. Были проведены исследования, которые доказали, что определенные виды иммунотерапии могут увеличивать эффективность лечения рака. В отличие от химиотерапии, иммунотерапия имеет целый ряд преимуществ. Иммунотерапия может быть активной и пассивной. Во время активной иммунотерапии задействуются ресурсы собственной иммунной системы. Пассивная иммунотерапия проводится с введением в организм специальных антител, которые уничтожают раковые клетки. К такому лечению относят терапию цитокинами и ингибиторами контрольных точек.

Одной из важных групп являются цитокины, содержащие интерлейкин-2 и интерфероны. Интерлейкин-2 усиливает биологический ответ (стимулирует выработку Т-лимфоцитов), применяется в качестве иммунотерапии при прогрессирующих формах рака почки. Интерфероны синтезируются иммунной системой, применяются в лечении рака как самостоятельная терапия или в комплексной терапии. Интерфероны замедляют рост раковых клеток, повышают чувствительность злокачественных клеток к другим иммунным клеткам. Исследования показали, что лечение рака почек интерфероном эффективнее, чем химиотерапией или гормональной терапией. Интерферон вызывает медленный регресс злокачественной опухоли, наибольший эффект достигается через три-четыре месяца после начала лечения.

В лечении лимфом используется химиотерапия в совокупности с моноклональными антителами – Mab. Моноклональные антитела действуют несколькими способами — распознают злокачественную клетку по антигену на поверхности клетки и подают сигнал иммунной системе на ее уничтожение. Антитела связываются с опухолевой клеткой, мешают ей развиваться, не дают опухоли расти, повышают эффективность химиотерапии в борьбе с опухолью.

При раке желудка применяют несколько методов иммунотерапии:

иммунотерапия адаптивными клетками. Использование клеток опухоли больного после культивирования in vitro;
иммунотерапия с помощью пептидов. Проводятся исследования, которые показали эффективность использования пептидов (MAGE3);
тумор-ассоциированные лимфоциты в комбинации с химиотерапией (без нее). Отмечено повышение выживаемости больных;
цитокин-индуцированные киллеры. Повышается выживаемость больных;
моноклональные антигены. Выживаемость больных соответствует выживаемости после проведения химиотерапии.

Лечение рака желудка находится на стадии исследований, ученые продолжают доказывать эффективность новой методики, искать возможность снижения побочных эффектов. Проводимая онкологическим больным иммунотерапия доказала свою эффективность, может использоваться как самостоятельное лечение, так и в совокупности с другими методами.

Рак легких имеет низкую иммуногенность – в клетках опухоли мало антигенов, которые играют роль мишени для иммунных клеток. Иммунотерапия при раке легкого показала эффективность, но в лечении наиболее распространенного вида рака – немелкоклеточного рака. В отношении мелкоклеточного и мезотелиомы продолжают проводиться исследования в области иммунотерапии, добиваясь эффективности этого метода.

GcMAF применяется для стимуляции иммунной системы, активации макрофагов. Макрофаги уничтожают все дефектные клетки в организме. GcMAF образуется в организме при встрече синтезируемого печенью белка и ферментов, принимается макрофагами как сигнал к фагоцитозу. При уничтожении макрофагами дефектных и аномальных клеток происходит выделение антигена. Антиген передает информацию Т-клеткам, В-клеткам, естественным клеткам-киллерам о виде патологической клетки. Это позволяет создать приобретенный, направленный ответ иммунной системы.

Лечение рака иммунотерапией в Москве проводится в клинике онкологии Юсуповской больницы. Клиника оснащена современным оборудованием ведущих мировых производителей медицинского оборудования. Высококвалифицированные врачи и медицинский персонал оказывают круглосуточную помощь. Больница имеет свой стационар, клиники неврологии, реабилитации, терапии, лечения зависимостей, хирургии. Записаться на консультацию можно по телефону Юсуповской больницы.

источник

Выбор субпопуляционно-специфического антитела к раку молочной железы с использованием фагового дисплея на тканевых срезах

Рак молочной железы состоит из гетерогенных популяций клеток. Эти популяции проявляют высокую дисперсию в морфологии, росте и метастатической склонности. Они по-разному реагируют на терапевтические вмешательства, а некоторые могут быть более склонны к повторению. Изучение отдельных субпопуляций рака молочной железы может дать важные знания для развития индивидуализированной терапии. Однако этот процесс оспаривается наличием биомаркеров, способных конкретно идентифицировать субпопуляции. Здесь мы демонстрируем подход для выбора фагового отображения фрагментов рекомбинантных антител на участках криостата ткани рака молочной железы человека. Этот метод позволяет выбирать рекомбинантные антитела, связывающиеся с антигенами, специфически выраженные в небольшой части участка ткани. В этом случае была нацелена субпопуляция CD271 + клеток рака молочной железы, и это могут быть потенциальные стволовые клетки рака молочной железы. Мы выделили фрагмент антитела LH 7, который в экспериментах по иммуногистохимии демонстрирует специфическое связывание с субпопуляциями рака молочной железы. Выбор фрагментов антител непосредственно на небольших определенных участках в большем разрезе злокачественной ткани является новым подходом, благодаря которому можно лучше нацеливать клеточную гетерогенность в протеомические исследования. Идентификация новых биомаркеров актуальна для нашего понимания и вмешательства в болезни человека. Выбор фрагмента LH 7, специфичного для рака молочной железы, может выявить новые специфические для субпопуляции биомаркеры, которые могут дать новые идеи и стратегии лечения рака молочной железы.

В онлайн-версии этой статьи (doi: 10.1007 / s12026-015-8657-x) содержится дополнительный материал, доступный для авторизованных пользователей.

Рак молочной железы характеризуется как очень гетерогенное заболевание [1]. Эта гетерогенность оспаривается для эффективного обнаружения, диагностики и лечения. Неоднородность при раке молочной железы сильно влияет на морфологию, скорость роста, метастатическую склонность, терапевтическую устойчивость и рецидив [2]. Неоднородность рака молочной железы существует как между опухолями как разные подтипы (межопухолевая гетерогенность), так и внутри данной опухоли (внутриопухолевая гетерогенность). Были идентифицированы множественные молекулярные подтипы среди пациентов, каждый из которых отличается по распространенности, прогнозу и подходу к лечению. Пять наиболее часто используемых классификаций для учета межопухолевой гетерогенности включают просвет A, просвет B, базальноподобный, HER 2 и нормальные подтипы [3-6]. Эти подтипы в основном отличаются выражением эстрогена, прогестерона, рецепторов ErbB2 и некоторых цитокератинов. Рак молочной железы также характеризуется внутриопухолевой гетерогенностью. Поэтому множественные биопсии, взятые из одной и той же опухоли, могут выявить глубокие геномные вариации, которые указывают на наличие или отсутствие различных субпопуляций в опухоли [7]. Две предложенные модели выдвинули гипотезу о причине внутриопухолевой гетерогенности. Согласно теории эволюции клона, генетические вариации в клетках первичной опухоли находятся под избирательным давлением, чтобы адаптироваться к их конкретной микроокружности [8]. Эти клетки накапливают генетические и эпигенетические изменения со временем, а давление отбора влияет на эволюцию. Наиболее адаптивные клетки становятся ответственными за прогрессирование опухоли и могут образовывать все более злокачественные, метастатические или лекарственно-устойчивые опухоли. Эта концепция подтверждается исследованиями, показывающими, что метастатический потенциал совпадает с генетической нестабильностью [9]. Другая гипотеза включает раковые стволовые клетки (CSC), которые были первоначально идентифицированы при остром миелоидном лейкозе, но с тех пор были зарегистрированы в самых разных формах рака [10]. Эта конкретная субпопуляция может инициировать опухоли, но также обладает способностью к самообновлению либо симметричным, либо асимметричным делением клеток, и они способны формировать иерархии дифференцирования в опухоли [11]. Эта дифференциация создает гетерогенные клеточные линии, которые составляют основную массу опухоли и играют разные роли при метастазировании, рецидиве опухоли и лекарственной устойчивости. Сегодня становится все более и более признанным, что эти две модели не являются взаимоисключающими. Исследования стволовых клеток лейкемии также показали, что эти специфические CSC могут сами подвергаться клональной эволюции [12]. Следовательно, различные субпопуляции рака молочной железы, встречающиеся в одной и той же опухоли, могут быть результатом как эволюции клонов, так и CSC [13]. Другое соображение заключается в том, что внутриопухолевая гетерогенность определяется не только внутренними факторами, но и сложной сетью клеточных взаимодействий с микросредой, в которой проживает опухоль. Было показано, что окружающие клетки стромы, внеклеточный матрикс, парацерновые факторы или местные состояния, такие как гипоксия, оказывают влияние на прогрессирование опухоли [14-17]. Микросреды могут также влиять на терапевтический ответ [18]. Таким образом, уникальные характеристики отдельной опухоли основаны на комбинации как внутриопухолевой гетерогенности, так и микроокружения опухоли.

Здесь мы используем технологию отображения фагов на ткани рака молочной железы криостата для генерации рекомбинантных фрагментов антител, которые специфически распознают субпопуляции. Мы применяем метод, который позволяет селекции быть нацеленными на небольшие субпопуляции первичных клеток рака молочной железы в ткани [19]. Использование ткани криостата в качестве биологического материала позволяет включить микроокружение опухоли в выборку, что может обеспечить фрагменты антител с высокой клинической значимостью. Отбор проводили против CD271 + клеток рака молочной железы непосредственно на ткани. Эти клетки не только обладают способностью инициировать опухоли, но также способны формировать иерархию дифференциации [20].

В этом исследовании мы демонстрируем выбор фрагмента антитела LH 7, который связывает антиген, выраженный некоторыми субпопуляциями рака молочной железы. Открытие LH 7 может позволить дальнейшую характеристику субпопуляций рака молочной железы и вывести новые идеи в область рака молочной железы.

Были подготовлены секции криостата (6-8 мкм) из заостренной биопсии пациентов с раком молочной железы и здоровых доноров, как описано [21]. Использование материалов для человека было рассмотрено Региональными научными комитетами по этике (регион Ховедстаден) и одобрено со ссылкой на H-2-2011-052 и H-2-2010-051. Тканевые секции, используемые для выбора, фиксировали в течение 10 мин в 3,7% формальдегиде (Sigma-Aldrich), промывали в PBS и инкубировали дважды в течение 7 мин в 0,01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich). Ядра контрастировали с гематоксилином (Sigma-Aldrich). Отбор проводили на базально-подобной ткани рака молочной железы у пациента 757 [22] с профилем маркера: (ER / PR — / -, цитокератин (CK) 17+, CK5 +, низкий ErbB2, MM + и CD271 +). Тканевые секции, используемые для иммуногистохимии (IHC), фиксировали в ледяном метаноле (Sigma-Aldrich) при -20 ° C в течение 5 мин. Использовались ткани из четырех пациентов с раком молочной железы, два базальноподобных рака молочной железы: P757 и P918 (ER-, CK17 +, CK5 +, MM- и CD271 +) и два рака молочной железы: P761 (ER / PR + / +, CK17-, CK5 +, низкие ErbB2, MM + и CD271 +) и P686 (ER / PR + / +, CK17-, CK5-, низкие ErbB2, MM + и CD271 +).

Вкратце, несколько разделов были разрезаны. Средняя часть была фиксирована метанолом и использовалась для иммунопероксидазы, в то время как другие секции были фиксированы формалином, как описано. Ткань из средней части была окружена блоком блокировки пептида PAP и заблокирована в течение 5 минут в блоке Ultra V (TA-060-UB, Thermo science). Ткань инкубировали в течение 1 часа с помощью 50 мкл мышиного анти-р75 NGF-рецепторного антитела (анти-CD271) [ME20.4] 1:50 (abcam, # ab8877), три раза промывали PBS (Ca2 + и Mg2 + свободным), а затем инкубировали с 50 мкл Ultravision ONE HRP Polymer (Thermo Scientific) в течение 30 мин, три раза промывали PBS и, наконец, инкубировали с тетрагидрохлоридом 3′-3′-диаминобензидина (DakoCytomation) в PBS с добавлением 1 мкл / мл 30% H2O2 (Sigma-Aldrich) в течение 10 мин. Слайд ткани промывали PBS и дистиллированной водой до того, как ядра были контрастированы с гематоксилином (Sigma-Aldrich). CD271 + раковые клетки были обнаружены в раковых гнездах в фиксированном метанолом участке. Соответствующие области были идентифицированы на формалинских участках и использовались для выбора теневой палочки.

Теневые палочки были изготовлены из выталкиваемых микрокапилляров (Tritech research, USA). Металлические диски были изготовлены путем прессования порошка из агломерата, любезно предоставленного Dansk Sintermetal (Дания). Плоские кусочки порошкообразного металла помещали на горловину микроскопа и прикрепляли к наконечнику вытянутого стеклянного капилляра, создавая небольшой объем эпоксидного клея в капилляр. Затем клей наносят сверху на кусок металла с требуемым размером. Эту процедуру выполняли с помощью капилляра, прикрепленного к микроманипулятору, чтобы обеспечить приклеивание диска к стержню под правильным углом. Это позволяет позиционировать диск поверх целевой области с помощью микроманипуляционного оборудования от Narishige (модель MM-188, Nikon, Tokyo, Japan). В этом исследовании использовалась теневая палочка диаметром около 150 мкм.

Секции тканей рака молочной железы из P757 фиксировали формалином и блокировали 1 ч в 4% сухого сухого обезжиренного сухого молока (MPBS). Слайд ткани инкубировали с библиотекой фага в контейнере для слайдов, содержащем 20 мл 2% MPBS в течение ночи при осторожном перемешивании. Использовалась однодоменная библиотека «хищник», которая имеет разный фрагмент 6,2 × 107 различных антител и титр 1013 БОЕ / мл с уровнем отображения, равным 6,4% [23]. В каждую секцию ткани использовали 50 мкл фагового запаса и инкубировали в течение ночи. Слайд промывали 10 мин в PBS и два раза в 10 мин в PBS с 10% глицерином (PBSG) с осторожным перемешиванием. Слайд высушивали, за исключением области мишени, которая была влажной, содержащей приблизительно 10 мкл PBSG. Используя яркую микроскопию, теневая палочка располагалась над целевой областью. Слайд подвергали воздействию света УФ-С (254 нм) в течение 5 мин с использованием источника УФ-С (модель UVSL-14P от UVP, Upland, CA, США), расположенного на подставке, расположенной примерно на 4 см выше слайда. Частицы фага, связанные с целевой областью, элюировали 15 мкл трипсина (1 мг / мл) в течение 15 мин. Трипсин отсасывали и переносили в пробирку до того, как площадь промывали 15 раз 50 мкл PBSG, который также переносили в элюат. Для инактивации трипсина к элюату добавляли 50 мкл фетальной бычьей сыворотки перед хранением при -20 ° C.

Миоэпителиальные клетки были выделены из трипсинированных органоидов, полученных из нормальной ткани молочной железы, как описано ранее [24]. Трипсинированные клетки инкубировали с флуоресцентным моноклональным анти-NGFR (рецептор нейротрофина, p75) / CD271-APC (ME20.4, 1:50, Cedarlane Laboratories) в течение 45 мин при 4 ° С, а затем промывали 2x в буфере HEPES, дополненным 0,5 % BSA (бычья фракция V, Sigma-Aldrich) и 2 мМ EDTA (Merck) и, наконец, инкубировали с 1 мкг / мл пропидиум-иодида (Life Technologies) для отделения живого из мертвых клеток до анализа и сортировки с использованием проточного цитометра FACSAria I ( BD Biosciences). Сортированные клетки были установлены в культуре на коллагеновых колбах с средой BBMYAB. Установление и культивирование субклона CD271 + из линии раковых клеток BT474 проводили, как описано [20].

Фаговую инфекцию E. coli и продуцирование фаговых антител проводили, как описано [19]. Первоначальный скрининг потенциальных интересных фаговых антител проводили на CD271 + раковых клетках. Тест на титрование проводили одновременно как на раковых клетках CD271 +, так и на нормальных CD271 + миоэпителиальных клетках, что давало возможность отказаться от фаговых антител, связывающихся с общими антигенами. Анализы проводили, как описано [19]. В качестве положительного контроля для фаговой ELISA-процедуры использовали фаговое антитело 52 [25]. В качестве отрицательного контроля было включено антитело к фагу, специфичное против эмпсилон-гемоглобина плода [26]. Для анализа титрования заинтересованные фаговые антитела получали в 50 мл TG-1 культурах и тестировали вместе с вышеупомянутыми контрольными последовательностями из пяти четырехкратных серийных разведений в диапазоне от 1011 фагов / лунок до 3,9 × 108, как описано [19]. Частицы фага определяли количественно путем измерения поглощения при 269 нм и 320 нм [23].

Чтобы выразить отдельные клоны в виде растворимых фрагментов антител, они были субклонированы от хищника-фагемида в модифицированный вектор pET22b, включая c-Myc- и His-tag с использованием рестрикционных ферментов NcoI и NotI (Thermo Scientific) и ДНК-лигазы T4 (фермента) до преобразования в BL21 Gold (Agilent Technologies). Экспрессию инициировали с культурой в течение 4 мл в течение ночи в среде ТБ, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и глюкозу (4% мас. / Об.). Культуры разбавляли 1: 100 в 250 мл культурах и выращивали до OD600 0,6-0,8, а затем центрифугировали в течение 10 мин при 4 ° С и 4000 об / мин. Осадок повторно суспендировали в среду ТБ, содержащую ампициллин (100 мкг / мл) и IPTG (100 мкг / мл) для индукции и выращивали в течение 16-18 ч при 30 ° С и 200 об / мин. Культуры центрифугировали в течение 1 ч при 5000 г при 4 ° С и фрагменты антитела в супернатанте осаждали 30% мас. / Об. Сульфата аммония путем инкубации на роликовом столе при 4 ° С в течение ночи. Колбы центрифугировали в течение 30 мин при 5000 г при 4 ° С и осадок повторно суспендировали в 40 мл TBS (pH 8) приблизительно с 400 U ДНКазой I (Roche), включая 5 мМ Mg +. Раствор стерилизуют фильтрованием с фильтрами 0,20 мкм (предварительные фильтры GF) и очищают на колонках HiTrap Protein A HP (GE Healthcare). Фракции, содержащие фрагменты антител, определяли с помощью SDS-PAGE, объединяли в диализную трубку диаметром 3,5 кДа (Spectrum Laboratories) и диализовали в 3 л TBS pH 7,5 при 4 ° С в течение ночи при осторожном перемешивании. Диализованный белок переносили в колонку VivaSpin 3 кДа (GE Healthcare) и концентрировали до концентрации около 1 мг / мл, измеренной на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Чистоту проверяли с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга против c-Myc.

Секции тканей готовили, как описано ранее. Ткань была окружена ручкой PAP и блокирована в течение 1 часа блоком Ultra V (TA-060-UB, Thermo science). Примерно 25 мкг фрагментов антител растворяли в блоке Ultra V, 10% козьей сыворотки и 1: 100 анти-CK19 до общего объема 100 мкл и добавляли в окруженную область. Инкубацию проводили в течение 3 ч во влажных камерах. Жидкость удаляли путем аспирации, и слайд промывали четыре раза 1 мин в PBS. Слайд инкубировали в течение 30 мин в темноте с мышиным Cy3-конъюгированным анти-c-Myc-антителом [9E10] 1: 250 (Sigma-Aldrich), Alexa Fluor 488-конъюгированным козьим антимышиным IgG2a 1: 500 (Invitrogen), DAPI 1: 1000 (Invitrogen) и 10% козьей сыворотки, растворенной в блоке Ultra V до 100 мкл. Альтернативно, фрагменты антител выше были заменены антителом против Ki67 (Abcam) в разведении 1: 100 и в качестве вторичного антитела к антителу против кролика козы, соединенного с Alexa 546 (Life technologies), добавляли при разведении 1 : 500. Слайд промывали три раза 1 мин в PBS и устанавливали с помощью монтажных сред Fluoromount (Sigma-Aldrich) и покрывного стекла.

Процедура выбора теневой палочки на срезах ткани криостата основана на нашей предыдущей опубликованной работе [19]. Схема подхода выбора и скрининга, применяемого в этом исследовании, может быть обнаружена на рисунке 1. Выборы были выполнены с использованием новой библиотеки однофазных фаговых антител, называемой «хищником» [23]. 1Иллюстрация процедуры отбора фрагментов антител и стратегий скрининга. Целевая область для выбора была выбрана как средняя часть определенного гнезда рака из-за присутствия здесь кластерного окрашивания CD271 +. Затем всю ткань в последовательном фиксированном формалине разделе инкубировали с фаговой библиотекой. Целевая область была перемещена, и минутный диск (теневая палка) был расположен точно над целевыми клетками, представляющими интерес. Целевая область всегда была влажной. Теневая палочка защищала фаговые антитела, связывающиеся с клетками, представляющими интерес, из-за облучения УФ-С. Фаги элюировались, но только защищенные теневой палочкой могут реплицироваться в бактериях и обеспечивать устойчивость к ампициллину. Каждая колония представляла собой фрагмент антитела, который требовал скрининга на предмет их специфичности. Их собирали и выращивали в отдельных колодцах мастерской. (1) При первоначальном скрининге все колонии выращивали в планшетах для микротитрования и получали моноклональные фаговые антитела. Фейковые антитела тестировали с помощью фагового ELISA на CD271 + раковые клетки. (2) Все фаговые антитела, связывающиеся с более высокой аффинностью, чем отрицательный контроль при первоначальном скрининге, получали моноклонально в 50 мл культурах. Они были протестированы в разных концентрациях с помощью анализа титрования на основе фага ELISA, который проводился одновременно на раковых клетках CD271 + и CD271 + миоэпителиальных клетках. Это дает сравнительные результаты каждого фагового антитела. (3) Фрагменты растворимых антител были экспрессированы и очищены и исследованы экспериментами IHC на четырех различных биопсиях рака молочной железы, чтобы подтвердить их специфичность

Выборы выполнялись на нескольких участках из одной биопсии (P757), которая имела небольшие четко определенные гнезда опухолевых клеток и редкое окрашивание CD271 + по всей ткани. Целевая область была выбрана как кластер с высокой плотностью CD271 + клеток в пределах одного гнезда рака (рис.1). Теневая палка защищала примерно 75-100 клеток. Структурные изменения представления антигенов могут возникать на нескольких этапах иммуноокрашивания CD271. Поэтому выбор выполнялся на отдельных, но последовательных не окрашенных участках ткани, чтобы сохранить антигены наилучшей способностью. Последовательные слайды фиксировались формалином и использовались в свежем виде, а целевая область была влажной во всех стадиях процедуры отбора. Точная соответствующая целевая область была легко идентифицирована на соседних слайдах с помощью уникальных морфологических моделей гнезд опухолевых клеток.

Тринадцать выборок выполняли на секциях криостата пациента 757 рака молочной железы с использованием теневой палочки на целевой области, как описано; 315 клонов первоначально подвергали скринингу с помощью ELISA фага на CD271, экспрессируя раковые клетки с помощью фаговых антител, полученных в 96-луночном формате. Фаговое антитело «эпсилон» специфично против эпсилон-гемоглобина, почти исключительно выраженного эмбриональными эритробластами [26]. Это фаговое антитело было включено как отрицательный контроль при первоначальном скрининге ELISA. Его значение поглощения было выбрано как значение отсечки для определения того, какой из 315 клонов следует дополнительно проанализировать. Первоначальный экран ELISA служит единственной цели определения приоритетов клонов для дальнейшего анализа. Просеивание дало 35 фаговых антител с более высокой поглощающей способностью по сравнению с отрицательным эпсилонным контролем. Выводы выбора библиотеки хищника обычно были хорошего качества, и секвенирование отдельных генов, кодирующих эти 35 антител, представляющих интерес, не выявило стоп-кодонов, усечений, мутаций сдвига рамки или других аномалий, как ожидалось. 35 фаговых антител продуцировали в 50 мл культуральных средах и тестировали с помощью ELISA с титационным фагом в серии из пяти четырехкратных серийных разведений в диапазоне от 1011 фагов / лунок до 3,9 × 108 фагов / лунку. Это выполнялось одновременно как на CD271 + раковых клетках, так и на CD271 + миоэпителиальных клетках. Это позволяет проводить сравнение между отдельными фаговыми антителами и двумя клеточными линиями. Фаговые антитела, связывающиеся одинаково хорошо или лучше с миоэпителиальными клетками, считались общими связующими эпитопами и не тестировались дальше. Одиннадцать из 35 протестированных фаговых антител были приоритетными для дальнейшей проверки, поскольку они лучше связывались с CD271 + раковыми клетками по сравнению с CD271 + миоэпителиальными клетками. Растворимые фрагменты антител экспрессировали и очищали перед валидацией с помощью IHC.

IHC проводили на криоконсервированной ткани груди из биопсий четырех разных больных раком. Все участки ткани были окрашены анти-CK19. Это помогает отличить раковые клетки с просветными характеристиками от окружающей стромы. Большинство испытуемых фрагментов растворимых антител не проявляли какого-либо специфического окрашивания, специфичного к раку, но довольно сильного окрашивания в окружающей строме. Однако фрагмент антитела LH 7 показал окрашивание в несколько кластеров мелких клеток в определенных гнездах опухолевых клеток. Эта картина окрашивания может указывать на то, что этот конкретный фрагмент антитела связан с некоторыми субпопуляциями рака молочной железы. Образец окрашивания этого фрагмента антитела не различает базальноподобный и просветный рак. Он связывает подмножества раковых клеток во всех тестируемых биопсиях рака. Примеры окрашивания, выполненные на той же самой базально-подобной биопсии рака (P757), которая используется при селекции, показаны на фиг. 2 и 3. На фиг.2 показано окрашивание при более низком увеличении для более репрезентативного вида и включает в себя контроль ki67 контроля пролиферации и отрицательный контроль. На рисунке 3 показано окрашивание при более высоком увеличении на трех разных участках в одной и той же секции ткани (P757). Пример окрашивания, выполняемый на просветной раке (P761), показан на рисунке 4. IHC также проводили на ткани груди у трех здоровых доноров, которые не проявляли никакого связывания с LH 7 (Sup. 1). 2Immunohistochemistry на трех отдельных участках ткани криостата от базальноподобного рака молочной железы пациента 757, той же биопсии, что и выбранная. Все снимки объединены с окрашиванием DAPI. Фотографии a, c и e показывают окрашивание CK19, которые указывают на наличие раковых клеток. Рисунок b показывает окрашивание фрагментом антитела LH 7, который последовательно связывается только с подмножеством раковых клеток. Присутствие раковых клеток подтверждается окрашиванием маркером пролиферации ki67 в этих областях, как показано на рисунке d. Картинки e и f взяты из другой области, чем изображение a-d, но это та же биопсия. Изображение f показывает окрашивание мышиным Cy3-конъюгированным анти-c-Myc-антителом, используемым для обнаружения фрагментов антител. Это показывает, что наблюдаемое окрашивание не вызвано повышением экспрессии c-Myc в раковых клетках или неспецифическим связыванием этим вторичным антителом

Иммуногистохимия показывает три разных области на одном и том же участке ткани криостата от базальноподобного рака молочной железы пациента 757. Все снимки сливаются с окрашиванием DAPI. Фотографии a, c и e показывают окрашивание CK19. Рисунок b показывает окрашивание фрагментом антитела LH 7 и представляет собой ту же самую область, что и на фиг.2b, но при более высоком увеличении. Фотографии d и f представляют собой окрашивание LH 7 из других областей. Хотя все фотографии взяты из одной и той же биопсии, в шаблоне окрашивания есть небольшие изменения. Изображение f показывает более уплотненное или сгруппированное окрашивание по сравнению с двумя другими областями

Иммуногистохимия выполнена на ткани криостата от рака молочной железы у пациента 761. Все снимки слиты с окрашиванием DAPI. Фотографии a и c показывают окрашивание CK19. Рисунок b показывает окрашивание LH 7, которое связывает только подмножество раковых клеток. Изображение d — это то же самое место, что и в b, но при более высоком увеличении. Окрашивание, проведенное на этой биопсии, показало несколько более высокую частоту связывания с раковыми клетками, и окрашивание, как правило, было менее сгруппированным по сравнению с окрашиванием на базальноподобных раках

В этой статье описывается выбор доменного антитела LH 7, который при повторных экспериментах по иммуногистохимии распознает только мелкие клеточные кластеры в определенных гнездах опухолевых клеток. Этот шаблон окрашивания указывает на то, что LH 7 может распознавать субпопуляцию рака молочной железы.

Принцип представленного подхода основан на выборе фрагментов антител, связывающихся с выбранной минутной областью ткани рака молочной железы, представляющей интерес. Это стало возможным благодаря использованию дисплея фага и теневой палочки. Теневая палочка защищает частицы фага, связывающиеся с целевой областью, от воздействия UV-C, что делает все незащищенные частицы фага неотъемлемыми в E.Coli. Такой подход дает низкий выход клонов из каждого отбора, при этом генерирует относительно высокую частоту фаговых антител, связывающихся с уникальными или повышенными антигенами.

Выборы проводились на базально-подобной секции рака молочной железы с помощью кластера с высокой плотностью CD271 + клеток в пределах одного гнезда рака. Эти клетки CD271 + могут быть классифицированы как стволовые клетки рака молочной железы [20]. Чтобы сохранить структурное представление антигенов, целевая область CD271 + была идентифицирована на отдельном слайде, а выбор выполнялся на соседних соседних слайдах. Поскольку клетки CD271 + были нацелены в гнезда опухолевой клетки на ткани, скрининг рекомбинантных антител с помощью ELISA фага проводили на CD271 + клетках рака молочной железы, которые были клонированы одной клеткой из клеточной линии рака груди BT474. При первоначальном скрининге ELISA на фаге было проверено 315 фаговых антител из 13 вариантов. Поскольку статус CD271 + распространен в миоэпителиальных клетках, окружающих гнезда опухолевых клеток в ткани, эти клетки были удобны с целью идентификации и отбрасывания связующих с общими эпитопами, включая связующие с антигеном CD271. Тридцать пять фаговых антител от первоначального скрининга показали более высокое поглощение, чем эпсилон, и были протестированы с помощью анализа титрования как на раковых клетках CD271 +, так и на CD271 + миоэпителиальных клетках. В этом анализе представляла интерес не интенсивность значений поглощения, а скорее разница связывания между двумя типами клеток. Эти анализы скрининга и титрования помогли определить приоритетность выбранных фаговых антител для дальнейшей оценки с помощью IHC.

IHC проводили с 11 различными фрагментами растворимых антител на участках из той же самой биопсии, что и выбранные для обеспечения тестирования в той же микроокружности опухоли, которую они первоначально связывали. Кроме того, использовались три другие биопсии, поскольку рак молочной железы может сильно различаться при гетерогенности опухоли и фенотипе. Эксперименты IHC повторяли с различными партиями очищенных фрагментов антитела с аналогичными результатами. Фрагмент антитела LH 7 последовательно обнаруживал связывание с подмножествами раковых клеток в гнездах опухолевых клеток во всех четырех различных биопсиях рака. Следовательно, этот конкретный фрагмент антитела распознает антиген, выраженный субпопуляцией рака молочной железы. Окрашивание, проведенное на биопсии лучевого рака у пациента 761 (фиг.4), как правило, показало более высокую частоту окрашивания раковых клеток, что указывает на то, что субпопуляция, выражающая родственный антиген LH 7, может существовать более часто в этой конкретной биопсии. Наблюдались также заметные различия в окрашивающей структуре в отношении плотности окрашивания как на том же участке (фиг.3), так и на другом подтипе рака молочной железы (фиг.4). В некоторых областях окрашивание было более сгруппировано в группы когерентных клеток (фиг.3f), а в других областях оно было более рассеяно вокруг отдельных раковых клеток. Такие различия очень ожидаются из-за неоднородности рака молочной железы.

Эксперименты с иммуногистохимией показывают, что один из выбранных фрагментов антител, LH 7, по-видимому, специфичен для определенных субпопуляций рака молочной железы. Идентификация и характеристика субпопуляций рака молочной железы могут дать новые стратегии понимания и лечения. Дальнейшие исследования, идентифицирующие и характеризующие субпопуляции, признанные LH 7, могут быть очень ценными для понимания внутриопухолевой гетерогенности при раке молочной железы и разработки новых стратегий диагностики и лечения. Кроме того, антитело само по себе может иметь перспективы в разработке реагентов для целенаправленной терапии.

Иммуногистохимия на участках тканей молочной железы у трех здоровых доноров для дальнейшей характеристики LH 7. Рисунок A, D и G показывают окрашивание DAPI. B, E и H показывают окрашивание против CK19. Рисунок C, F и I показывают окрашивание фрагментом антитела LH 7. Верхняя, средняя и нижняя ряды представляют здоровые доноры P671, P820 и P923 соответственно. Не наблюдалось никакого окрашивания ни в здоровых просветных клетках, ни в строме (TIFF 5157 kb)

Мы благодарим Benedikte Thuesen, Københavns Privatospital и доноров за предоставление любого нормального материала для биопсии молочной железы и Вера Тиммерманс Веленга, отдел патологии, Ригшоспиталет, за подтверждение нормальности ткани и предоставление любой раковой ткани. Эта работа была поддержана Фондом «Ново Нордиск», Датским советом по исследованиям и инновациям, Датским советом независимых исследовательских технологий и производственных наук и Сино-датским центром.

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

источник