Генетические полиморфизмы ассоциированные с развитием рака молочной железы

Определение генетических полиморфизмов BRCA1 и BRCA2, ассоциированных с риском развития рака молочной железы

Мы рады представить Вам новый вид исследования: Определение генетических полиморфизмов BRCA1 и BRCA2, ассоциированных с риском развития рака молочной железы

В мире ежегодно регистрируется более 1 миллиона случаев рака молочной железы (РМЖ), а в РФ свыше 57,9 тысяч (2010г). В структуре смертности женщин от злокачественных новообразований в России в 2011 году РМЖ занимал лидирующее место (17,3%). Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет почти 13 %. Очевидно, что эффективность лечения выше на ранних стадиях заболевания, поэтому своевременная диагностика является актуальной задачей и может привести к значительному снижению летальных исходов.

BRCA 1 и BRCA 2 – человеческие гены, известны как подавители опухолевого роста. В нормальной структуре BRCA 1 и BRCA 2 обеспечивают стабильность ДНК и помогают предотвратить их бесконтрольный рост. По литературным данным известно, что 5-10% случаев рака молочной железы и рака яичников являются наследственными и их развитие может быть связано с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. По данным Breast Canaer Linkage Consortium, выявленный полиморфизм в обоих генах увеличивает риск развития РМЖ у женщин к 80 годам на 80-85 % (BCLC, Familial Cancer.-2003.-Vol. 2, N3-4. P.18-32).

Ген BRCA 1 стал известен благодаря недавним действиям и заявлениям американской актрисы Анджелины Джоли, и определенно его будут называть – «ген Джоли». Из-за наличия мутации специфического гена BRCA1, выявленного по анализу крови на BRCA 1/2, у кинозвезды имелся 87% риск стать жертвой рака груди и 50% риск развития рака яичников. Джоли хирургически удалила обе груди, а в настоящее время планирует удаление яичников (напомним, мать Анджелина Джоли Маршелин Бертран умерла от рака яичников в 2007 году, а недавно скончалась от рака груди и ее тетя). В жизни женщины риск развития рака молочной железы и яичников значительно возрастает, если она наследует вредные мутации в генах BRCA 1 или BRCA 2. Такая женщина имеет повышенный риск развития этих заболеваний в раннем возрасте (до наступления менопаузы) и часто имеет несколько близких родственников, у которых был подобный диагноз.

Было показано, что BRCA1-ассоциированный рак молочной железы, в отличие от спорадического, характеризуется более высокой степенью злокачественности, высокой частотой развития эстроген- и прогестерон- отрицательных опухолей, частотой развития медуллярного рака, выраженной лимфоидной инфильтрацией, выраженным лечебным патоморфозом вплоть до полной регрессии. Установлено, что выживаемость больных наследственным раком органов женской репродуктивной системы значительно выше, чем в общей группе больных, независимо от стадии и проводимого лечения: 5-летняя выживаемость больных наследственным раком молочной железы составляет 75% (общепопуляционная – 43%) (Иванова О.С. и др., 2008).

Гены BRCA1 и BRCA2 не являются строго специфичными для рака молочной железы. Патологический генотип BRCA1/2 повышает риск возникновения рака яичников, желудка, толстой кишки, эндометрия, поджелудочной железы, мочевого пузыря, желчевыводящих путей, а также возникновения меланомы (Breast Cancer Linkage Concortium J. Natl. Cancer inst. – 1999. – Vol.91. – P. 1310-1316).

Мужчины с этими мутациями также имеют повышенный риск развития рака молочной железы. Также мужчины, которые имеют вредные мутации генов BRCA 1 или BRCA 2 могут иметь повышенный риск развития других видов рака — поджелудочной железы, яичек, предстательной железы.

Положительный результат BRCA анализа как правило указывает на то, что человек унаследовал известные вредные мутации в генах BRCA1 или BRCA2 и, следовательно, имеет повышенный риск развития некоторых видов рака. Тем не менее, положительный результат теста содержит информацию только о риске развития рака. BRCA анализ не может сказать, действительно ли у человека разовьется рак или когда это произойдет.

Отрицательный результат теста означает, что риск развития рака минимален, равен среднестатистическому в целом.

источник

Генотипирование BRCA1/2 (генетический полиморфизм, ассоциированный с риском развития рака молочной железы и яичников)

В развитых странах одна из 100 женщин заболевает раком молочной железы (РМЖ) в результате генетических нарушений. К настоящему времени найдено несколько генов, дефекты в которых могут приводить к развитию наследственного РМЖ. Так в 1994 году были открыты гены BRCA1/2. Считается, что до 70% всех случаев наследственного РМЖ обусловлены мутациями в этих двух генах. Таким образом, до 7% женщин, заболевших РМЖ, имеют наследуемые мутации в генах BRCA1/2. У носителей этих мутаций злокачественные опухоли в течение жизни развиваются с вероятностью до 90%. Риск развития заболевания в раннем возрасте приблизительно в 10 раз превышает общий риск в популяции.

Мутация-1 гена BRCA-1 185delAG (рак молочной железы и яичников)

Мутация-2 гена BRCA-1 5382insC (рак молочной железы и яичников)

Мутация-3 гена BRCA-1 Cys61Gly (рак яичников)

Мутация-4 гена BRCA-1 4153delA (рак молочной железы и яичников)

Мутация-5 гена BRCA-1 3819delGTAAA

Мутация-6 гена BRCA-1 3875delGTCT

Мутация-7 гена BRCA-1 2080delA

Мутация гена BRCA-2 6174delT (рак молочной железы и яичников)

Гены рака молочной железы 1 и 2 (BRCA-1 и BRCA-2) функционально препятствуют развитию рака молочной железы. Известно, что 5-10% случаев рака молочной железы и яичников являются наследственными и их развитие может быть связано с мутациями в генах BRCA-1 и BRCA-2. На настоящий момент известно около 1500 геновариантов BRCA-1 и BRCA-2, нарушающих функцию генов и приводящих к развитию заболевания. В раковых пациентах славянской популяции, а также этнической группы типа Ашкенази наиболее часто выявляются патогенные варианты 185delAG, T181G, 4153delA, 5382insC в гене BRCA-1 и 1528delAAAA, 1099SX C>G, 6174delT, 9318delAAAA в гене BRCA-2. Популяционная частота встречаемости данных распространенных мутаций достаточно низка (не более 1 %). Обнаружение перечисленных мутаций обычно связывается с увеличенным риском развития рака молочной железы и, в меньшей степени, рака яичников. Варианты BRCA-1 185delAG, 5382insC и BRCA-2 6174delT связывают с увеличением риска рака молочной железы при долговременном использовании пероральных контрацептивов. Вариант BRCA-1 185delAG или 5382insC соответствует более неблагоприятным степеням гистологической злокачественности опухоли. Полиморфизм BRCA-1 и BRCA-2 не является строго специфичным для РМЖ. Патологический генотип BRCA-2 повышает риск возникновения рака желудка, толстой кишки, эндометрия, поджелудочной железы, мочевого пузыря, желчевыводящих путей, а также возникновения меланомы.

Показания к назначению: атипические пролиферативные заболевания молочной железы, рак яичников, семейная история раковых заболеваний любой локализации, множественные первичные опухоли в одном органе или в разных органах, появление опухоли в раннем возрасте, длительное использование пероральных контрацептивов на фоне пролиферативных заболеваний молочной железы и яичников.

Рекомендации Национального Института Рака в Соединенных Штатах по профилактике РМЖ у носителей BRCA-мутаций:
• Самообследование молочных желез – с 18-20 лет (ежемесячно)
• Клиническое обследование – молочных желез и яичников с 25-35 лет (1-2 раза в год)
• Маммография – с 25-35 лет (ежегодно)
• УЗИ – с 25-35 лет (1-2 раза в год)
• ЯМР-томография – с 25-35 лет (ежегодно)
• Мониторинг СА 125 – с 25-35 лет по показаниям
• Профилактическая мастэктомия (с реконструкцией) – по показаниям
• Профилактическая овариэктомия (в постменопаузе) – по показаниям
Показания к назначению:

1. семейный анамнез (рак молочной железы, рак простаты или колоректальный рак в первой линии родства);
2. один родственник или более с тем же типом опухоли;
3. атипические пролиферативные заболевания молочной железы;
4. множественные первичные опухоли в том же органе;
5. множественные первичные опухоли в различных органах;
6. множественные первичные опухоли в парных органах;
7. мультифокальность внутри одного органа;
8. проявление опухоли в раннем возрасте;
9. два родственника и более с редкими формами рака;
10. два родственника или более с опухолью, относящейся к семейному раку;
11. три родственника или более в двух поколениях с опухолями одной локализации;
12. негативный результат тестирования на мутации генов BRCA1 и BRCA2.

Биологический материал для анализа : цельная кровь, стабилизированная ЭДТА

источник

ОнкоГенетика BRCA — определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития рака молочной железы и яичников, методом ПЦР в режиме реального времени

В мире ежегодно регистрируется более 1 миллиона случаев рака молочной железы (РМЖ), а в РФ свыше 50 тысяч. Заболеваемость раком молочной железы в России составляет 42,7 на 100000 населения (стандартизированные показатели за 2007 г).

Одной из самых распространенных проблем является высокая смертность от РМЖ. Летальность на первом году с момента установления диагноза равна почти 13%. Очевидно, что эффективность лечения выше на ранних стадиях заболевания, поэтому своевременная диагностика является актуальной задачей и может привести к значительному снижению летальных исходов.

Известно, что 5-10% случаев рака молочной железы и рака яичников являются наследственными и их развитие может быть связано с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2.

ПЦР лаборатория МЦ «Айболит» предлагает новое исследование ОнкоГенетика BRCA, которое включает восемь мутаций, представленных в таблице.

Оценка рисков и частота встречаемости различных генотипов

ПОЛИМОРФИЗМ (МУТАЦИЯ)

АЛЛЕЛЬ РИСКА

ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ ПРИ РМЖ

ОЦЕНКА РИСКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПАХ

Суммарная частота встречаемости около 5,9% в неотобранной выборке (1091 чел)

Было показано, что BRCA1-ассоциированный рак молочной железы, в отличии от спорадического, характеризуется более высокой степенью злокачественности, высокой частотой развития эстроген- и прогестерон-отрицательных опухолей, частотой развития медуллярного рака, выраженной лимфоидной инфильтрацией, выраженным лечебным патоморфозом вплоть до полной регрессии. Установлено, что выживаемость больных наследственным раком органов женской репродуктивной системы значительно выше, чем в общей группе больных, независимо от стадии и проводимого лечения: 5-летняя выживаемость больных наследственным раком молочной железы составляет 75% (общепопуляционная – 43 %) (Иванова О.С. и др., 2008).

Гены BRCA1 и BRCA2 не являются строго специфичными для РМЖ. Патологический генотип BRCA1/2 повышает риск возникновения рака яичников, желудка, толстой кишки, эндометрия, поджелудочной железы, мочевого пузыря, опухолей головы и шеи, желчевыводящих путей, а также возникновения меланомы (Breast Cancer Linkage Consortium J. Natl. Cancer Inst. – 1999. – Vol. 91. – P. 1310-1316).

Показания к генетическому тестированию:

• Семейный анамнез (рак молочной железы или рак яичников в первой линии родства)
• Атипические пролиферативные заболевания молочной железы
• Первично-множественные заболевания у пациентки или ее родственников
• Множественные первичные опухоли в том же органе
• Множественные первичные опухоли в различных органах
• Множественные первичные опухоли в парных органах
• Мультифокальность внутри одного органа
• Появление опухоли в раннем возрасте
• Один или более близкий родственник с тем же типом опухоли
• Два и более родственника с опухолями одной локализации
• Два или более родственника с опухолью относящейся к семейному раку
• Два и более родственника с редкими формами рака
• Три или более родственника в двух поколениях с опухолями одной локализации

Дополнительные факторы риска:

• Курение
• Частое употребление алкоголя
• Ранее менархе и позднее наступление менопаузы
• Бесплодие, поздние роды
• Пролиферативные заболевания молочной железы
• Ионизирующее облучение
• Наличие первичного рака яичников, эндометрия или толстой кишки
• Дефекты генов фолатного цикла

Стоимость исследования – 3200 рублей. Со скидкой 30% — 2300 рублей.

Срок исполнения – 3 рабочих дня.

источник

Определение генетических полиморфизмов гена BRCA, ассоциированных с риском развития рака молочной железы (8 точек)

Для определения степени риска возникновения у будущего поколения онкозаболеваний молочной железы используют специфическое исследование биологического материала на предмет наличия/отсутствия полиморфизмов маркеров BRCA. Мутации в этих генах ассоциируют с высокой вероятностью развития рака. Специалисты в режиме реального времени проводят цепную полимеразную реакцию. Анализ позволяет с высокой степенью детекции выявить и определить тип мутаций в конкретном гене.

Ученые определили, что рак яичников и молочных желез в 7-14% случаев является наследственным заболеванием, которое вызывают мутации (генетические полиморфизмы) в ряде генов (супрессоры) опухолевого роста. Маркерами заболевания считаются:

• BRCA1 — патологии гена обуславливают возможность возникновения рака ассоциированного типа. Отличаются значительной степенью злокачественности, вероятностью развития прогестерон- и эстроген-отрицательных образований и рядом серьезных осложнений;
• BRCA2 — полиморфизмы маркера обуславливают возникновение спорадического онкозаболевания.

Однако перечисленные гены не считаются исключительно специфическими для развития рака репродуктивных органов. Патологии в маркерах могут говорить о возможности развития у будущего поколения и иных онкозаболеваний: мочевого пузыря, толстой кишки, эндометрий, желчно-выводящих путей, меланомы и прочих. Оба гена отвечают (кодируют) за функциональную активность и синтез белка. Мутации обуславливают патологии процессов восстановления клеток — клеточный цикл не регулируется, что в 7 из 10 случаев становится причиной канцерогенеза. То есть естественная противоопухолевая защита (активность) белка резко падает (может быть полностью нарушеной).

Своевременное проведение исследований на предмет выявления генетических мутаций в маркерах-супрессорах BRCA1 и BRCA2 позволяет специалистам определить степень риска и характер онкозаболевания. А значит, вовремя принять меры по предупреждению развития (своевременному лечению) опухолевого образования.

В особую группу риска входят все женщина репродуктивного (25-55 лет) возраста, в чьем семейном анамнезе упоминаются онкологические заболевания рака молочной железы, яичников. Анализ рекомендуется проходить всем женщинам в первой линии родства. Помимо этого исследование назначается при:

• Обнаружении атипичных пролиферативных недугов груди;
• Диагностировании множественно-первичных образований в молочной железе, яичниках или иных органах;
• Появлении онкообразования в раннем возрасте;
• Первичном диагностировании у 1-2 родственников образований одинаковой локализации;
• Обнаружении редких форм рака.

Также анализ на выявление патологий в маркерах BRCA1 и BRCA2 могут назначить курильщицам, женщинам, подвергшимся ионизирующему облучению, имеющим дефекты генов, злоупотребляющих алкоголем, страдающим бесплодием или невынашиванием плода.

Цепная полимеразная реакция либо обнаружит, либо не обнаружит полиморфизмы. Если мутации в генах-маркерах отсутствуют, риска нет. Если мутации выявлены, то это говорит о том, что риск возникновения онкоопухолей вероятен. Однако интерпретировать результат анализа может только врач-онколог, который по типу и виду мутаций (оба гена представляют собой длинные цепочки, патология может быть не одна) определит возможную локализацию образования и рассчитает вероятность его развития.

Анализы Вопрос: Здравствуйте у мужа нашли половую инфекцию Enterococcus faecalis, какие анализы мне нужно сдать ?

уточнить цену Вопрос: Добрый день. Подскажите пожалуйста, мне нужно сдать комплекс анализов, однако в прейскуранте не все нашла. Рассчитайте мне какова сумма на сдачу данных анализов: Комплекс «Безопасный секс» +кровь на ВПГ1.2.6 ТИПЫ И цмви (Lg M и G). спасибо.

источник

Уважаемые пациенты! Каталог анализов в настоящее время находится в стадии наполнения информацией и содержит в себе далеко не все выполняемые нашим центром исследования. Филиалами Центра эндокринологии проводится более 700 видов лабораторных анализов. С их полным списком Вы можете ознакомиться здесь.

Пожалуйста, уточняйте информацию о стоимости услуг и подготовке к анализам по телефонам (812) 344-0-344, +7 953 360 96 11. При сдаче анализов крови, пожалуйста, учитывайте стоимость забора биоматериала.

Генетическое комплексное исследование, дающее возможность определения наследственной предрасположенности применительно к раку молочной железы, а также яичников.

Рак молочной железы, яичников являются одними из наиболее часто встречающихся онкологических патологий. Наличие мутаций в таких генах, как BRCA1, BRCA2, может повышать вероятность возникновения рака молочной железы и рака яичников в несколько раз. Средний возраст возникновения патологии при этом понижается примерно до 25-30 лет. Также отмечено, что чем старше становится человек, тем вероятность рака у него выше.

Обнаруженные семейные случаи болезни свидетельствуют в первую очередь о наследственной природе злокачественного поражения и требуют проведения генетического анализа. Показано, что в организме гены BRCA1, BRCA2 принимают участие в защите его от спонтанных повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), поэтому нарушение функционирования их создает предпосылки для накопления мутаций и ведет к появлению опухолей, в первую очередь — развитию рака молочной железы, яичников. Исследования показали, что для рака, сочетающегося с маркерами BRCA, характерна высокая степень злокачественности, а также выраженная лимфоидная инфильтрация.

В разных странах отмечается свой спектр мутаций применительно к генам BRCA, ассоциированным с раком груди. В России на сегодняшний день идентифицированы специфичные для нее мутации.

Популяционная частота известных мутаций составляет не более 1%. При этом, однако, риск развития рака молочной железы или яичников на протяжении жизни для женщин с генетической предрасположенностью достигает 80%.

Важно отметить, что исследование можно выполнять в любом возрасте. При обнаружении нарушений по исследуемым маркерам будет начато своевременное лечение.

Для успешного лечения заболеваний опухолевой природы весьма важным является обнаружение новообразования на ранней стадии, до появления каких-либо признаков. По этой причине генетическая предрасположенность в плане рака груди и яичников является весьма серьезным показанием к прохождению регулярного обследования с целью обнаружения патологии на ранней стадии.

Некоторые факторы риска возникновения рака молочной железы: стресс; злоупотребление алкоголем; курение; бесплодие; пролиферативные болезни молочной железы; поздние роды; позднее наступление менопаузы; первичный рак яичников и эндометрия, колоректальный рак; наличие дефектов генов так называемого фолатного цикла (MTHFR); ионизирующее облучение, в том числе лучевая терапия.

О правилах подготовки к исследованию спрашивать у лечащего врача и врача лаборатории.

Приведены лишь некоторые процессы, состояния и заболевания, при которых целесообразно назначение данного анализа.

Изучение риска развития наследственного рака молочной железы и яичников может проводиться в случае рака молочной железы, яичников в анамнезе семьи (у родных первой и второй степени родства, особенно в том случае, если заболевание было в раннем возрасте); при обнаружении мутаций генов BRCA1, BRCA2 у родных; при наличии двустороннего рака груди у пациентки, а также/или у ее родственников; при наличии рака груди, а также предстательной железы (простаты) у мужчин в анамнезе семьи; при появлении новообразования в раннем возрасте; при наличии атипичных пролиферативных патологий молочной железы; при наличии множественных первичных новообразований в разных органах у женщины, а также/или у ее родных; в случае если у 2 и более родных больного имелись новообразования одной локализации, редкие разновидности рака.

Осуществляется врачом лаборатории и лечащим врачом. Следует помнить, что результат исследования может не всегда являться достаточным критерием для формирования заключения. Представленная информация никоим образом не служит целям самодиагностики и самолечения. Окончательный диагноз устанавливается только врачом при сочетании полученных данных с результатами других методов исследования.

источник

Комплект реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития рака молочной железы, методом ПЦР в режиме реального времени.

В мире ежегодно регистрируется более 1 миллиона случаев рака молочной железы (РМЖ), а в РФ свыше 50 тысяч. Заболеваемость раком молочной железы в России составляет 38,9_ на 100 000 населения (стандартизованные показатели за 2002 г).

Одной из самых распространенных проблем является высокая смертность от РМЖ. Летальность на первом году с момента установления диагноза равна почти 13%. Очевидно, что эффективность лечения выше на ранних стадиях заболевания, поэтому своевременная диагностика является актуальной задачей и может привести к значительному снижению летальных исходов. Известно, что 5-10% случаев рака молочной железы и рака яичников являются наследственными и их развитие может быть связано с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. По данным Breast Cancer Linkage Consortium, оба гена увеличивают риск развития РМЖ у женщин к 80 годам на 80-85% (BCLC, Familial Cancer. — 2003. — Vol. 2, N 3-4. — P. 18-32).

Было показано, что BRCA1-ассоциированный рак молочной железы, в отличие от спорадического, характеризуется более высокой степенью злокачественности, высокой частотой развития эстроген-и прогестерон-отрицательных опухолей, частотой развития медуллярного рака, выраженной лимфоидной инфильтрацией, выраженным лечебным патоморфозом вплоть до полной регрессии. Установлено, что выживаемость больных наследственным раком органов женской репродуктивной системы значительно выше, чем в общей группе больных, независимо от стадии и проводимого лечения: 5-летняя выживаемость больных наследственным раком молочной железы составляет 75% (общепопуляционная — 43%) (Иванова О.С. и др., 2008).

Гены BRCA1 и BRCA2, не являются строго специфичными для РМЖ. Патологический генотип BRCA1/2 повышает риск возникновения рака желудка, толстой кишки, эндометрия, поджелудочной железы, мочевого пузыря, опухолей головы и шеи, желчевыводящих путей, а также возникновение меланомы (Breast Cancer Linkage Consortium J. Natl. Cancer Inst. — 1999. — Vol. 91. — P. 1310-1316).

Преимущества определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития рака молочной железы, методом ПЦР в режиме реального времени:

1. Технологичность (стандартные методики ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени)
2. Высокая скорость
3. Автоматическая выдача результатов (прибор ДТ-96)
4. Низкая стоимость анализа

1. семейный анамнез (рак молочной железы или рак яичников в первой линии родства)
2. атипические пролиферативные заболевания молочной железы
3. первично-множественные заболевания у пациентки или ее родственников
4. множественные первичные опухоли в том же органе
5. множественные первичные опухоли в различных органах
6. билатеральные первичные опухоли в парных органах
7. мультифокальность внутри одного органа
8. появление опухоли в раннем возрасте
9. один или более близкий родственник с тем же типом опухоли
10. два и более родственника с опухолями одной локализации
11. два или более родственника с опухолью относящейся к семейному раку
12. два и более родственника с редкими формами рака
13. три или более родственника в двух поколениях с опухолями одной локализации

1. курение
2. частое употребление алкоголя
3. позднее наступление менопаузы
4. бесплодие, поздние роды
5. пролиферативные заболевания молочной железы
6. ионизирующее облучение
7. наличие первичного рака яичников, эндометрия или толстой кишки
8. дефекты генов фолатного цикла

При обнаружении мутаций необходимо обратиться к врачу онкологу-маммологу или в специализированные онкологические центры, где будет назначено профилактическое лечение, форма которого зависит от возраста пациента и клинической ситуации.

Реагенты предназначены для использования в лабораториях, оснащенных детектирующими термоциклерами для ПЦР с выдачей результатов в режиме реального времени ДТ-96, ДТ-322.

Пробирки для ПЦР-анализа, адаптированные для работы с термоциклером в режиме реального времени (0,2 мл).

При использовании термоциклеров ДТ-96 и ДТ-322 у врача-лаборанта в распоряжении имеется русскоязычная программа, которая автоматически обрабатывает полученные данные, что значительно экономит время исследования. Кроме того, программа позволяет выдавать результаты в удобной и наглядной форме.

источник

МРТ молочных желез. Стрелочка указывает на опухоль

Nevit Dilmen, Wikimedia Commons

Генетики обнаружили 65 новых полиморфизмов в ДНК, ассоциированных с риском развития рака груди и еще десять, связанных с определенным его типом (эстроген-нечувствительным раком). Кроме того, большинство этих полиморфизмов удалось связать с изменением в регуляции активности конкретных генов, что расширило знания ученых о механизмах развития заболевания. Работы, опубликованные в Nature и Nature Genetics стали результатами нескольких масштабных международных проектов по исследованию генетики и механизмов развития рака груди.

Предрасположенность ко многим распространенным типам рака наследуется. Для рака груди количество семейных случаев насчитывает от пяти до десяти процентов от всех случаев развития болезни, однако близнецовые исследования показывают, что генетическая предрасположенность к развитию рака может объяснять до 40 процентов всех случаев. Самый высокий риск обусловлен мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, которые кодируют компоненты системы репарации ДНК. К примеру, в 70-80 процентах случаев ER-негативный (эстроген-нечувствительный) рак молочной железы развивается у носительниц мутаций в гене BRCA1.

Для того чтобы вычислить риск развития заболевания, генетики занимаются поиском вариантов в ДНК (однонуклеотидных полиморфизмов), которые с большей вероятностью встречаются у женщин с диагностированным раком груди, чем у здоровых. В подавляющем большинстве случаев вклад единичного полиморфизма незначителен, однако на основе большого числа вариантов генетики определяют степень риска (risk score), которая количественно отражает предрасположенность к развитию заболевания.

До сих пор было известно около 120 полиморфизмов, ассоциированных с риском развития рака груди. Теперь, по итогам нескольких больших международных проектов ученые обнаружили еще 65 новых. Суммарно в опубликованном в Nature исследовании было задействовано более 120 тысяч женщин европейского происхождения и 14 тысяч азиатского с раком груди, а также 120 тысяч здоровых женщин.

Половина участниц была генотипирована при помощи теста OncoArray. В рамках этого проекта международная команда исследователей разработала тест для определения 570 тысяч однонуклеотидных полиморфизмов, включая редкие варианты и известные варианты, ассоциированные с различными видами рака. Образцы были собраны в результате 68 отдельных исследований, проведенных международным консорциумом по исследованию генетики и механизмов развития рака груди (BCAC). Данные для другой половины участниц были собраны в результате мета-анализа 12 крупных полногеномных исследований. Всего ученые проанализировали связь с заболеванием для 11,8 миллионов известных полиморфизмов.

По итогам исследования количество известных генетических вариантов, ассоциированных с риском развитием рака молочной железы, выросло до 180. Суммарно эти варианты вносят вклад в 18 процентов семейных случаев болезни, однако исследователи утверждают, что потенциал теста OncoArray не раскрыт до конца, и с его помощью можно обнаружить варианты для 40 процентов случаев. Большинство этих вариантов попадает в некодирующие области генома, то есть связано с регуляцией активности генов.

В опубликованном отдельно исследовании консорциум обнаружил десять новых полиморфизмов, ассоциированных с риском развития ER-негативного рака молочной железы у женщин европейского происхождения. Кроме того, ученые подтвердили десять ранее опубликованных полиморфизмов, связанных с этим типом рака. Данные были собраны также при помощи анализа OncoArray в ходе исследований BCAC и CIMBA (Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2) —консорциума по изучению вклада в развитие рака мутаций в генах BRCA. Большая часть мутаций, связанных с ER-негативным раком, при этом не была ассоциирована с ER-позитивным, что говорит о независимых механизмах возникновения двух типов заболевания. По словам исследователей, 20 найденных вариантов, вкупе с сотней обнаруженных ранее, объясняют 16 процентов наследственных случаев ER-негативного рака молочной железы.

Таблица с перечислением десяти полиморфизмов (SNP), ассоциированных с ER-негативным раком груди, с привязкой к конкретным генам

источник

Восстановление ДНК путем гомологичной рекомбинации является одним из основных процессов восстановления ДНК двухнитевых разрывов. В настоящей работе мы провели исследование случай-контроль (304 случая и 319 контролей), чтобы проверить связь между генотипами c.-61 G> T и g.38922 C> G полиморфизмами гена RAD51, а g .96267 A> C и g.85394 A> G полиморфизмы гена BLM и рака молочной железы. Генотипы определяли в ДНК из периферической крови с помощью ПЦР-RLFP и с помощью ПЦР-CTPP. Мы наблюдали связь между возникновением рака молочной железы и генотипом T / G (OR 4.41) полиморфизма c.-61 G> T-RAD51, генотипом A / A (OR 1.69) g.85394 A> G-BLM полиморфизм и генотип A / A (OR 2.49) полиморфизма g.96267 A> C-BLM. Кроме того, мы продемонстрировали корреляцию между комбинациями генотипов внутри- и интергенами и возникновением рака молочной железы. Мы обнаружили корреляцию между экспрессией рецептора прогестерона и генотипом T / G (OR 0,57) полиморфизма c.-61 G> T-RAD51. Мы также обнаружили корреляцию между генотипом T / G (OR 1.86) и генотипом T / T (OR 0,56) полиморфизма c.-61 G> T-RAD51 и метастазами в лимфатические узлы. Мы показали связь между генотипом A / A (OR 2.45) и генотипом A / C (OR 0,41) полиморфизма g.96267 A> C-BLM и класса опухоли G3. Наши результаты показывают, что вариабельность генов RAD51 и BLM может играть роль в возникновении рака молочной железы. Эта роль может быть подчеркнута общим взаимодействием между этими генами.

Рак молочной железы является одной из основных причин смерти от рака среди женщин в мире. Прогресс во многих областях науки позволил понять механизм канцерогенеза в молочной железе, но до сих пор не было выявлено каких-либо явных причин рака молочной железы. Две основные группы факторов риска развития рака молочной железы являются генетическими и экологическими, среди которых наиболее важными являются возраст и рак молочной железы у первых и / или второстепенных родственников. В этом случае особенно важны мутации в двух генах с высокой проникающей способностью BRCA1 и BRCA2 [1, 2], которые связаны с процессами восстановления двойных нитей ДНК (DSB). В ряде исследований показана связь между наследственным, а также спорадическим раком молочной железы и генетической нестабильностью, вызванной DSB [3-6]. DSB могут быть восстановлены с помощью негомологичного концевого соединения (NHEJ) [7], восстановления гомологичной рекомбинации (HRR) [8] и одноцепочечного отжига (SSA) [9]. Тем не менее, было установлено, что HRR является ключевым путем в клетках человека для восстановления DSB [10]. Восстановление ДНК путем гомологичной рекомбинации особенно важно во время и после репликации ДНК, когда в качестве шаблона для восстановления присутствует сестра-хроматида. У эукариот центральный гомологичный рекомбинационный белок представляет собой RAD51, который катализирует перенос нити между сломанной последовательностью и ее неповрежденным гомологом, чтобы обеспечить повторный синтез поврежденной области [10-13]. BLM helicase физически и функционально взаимодействует с RAD51 и, как сообщается, вытесняет RAD51 из нуклеопротеиновой нити, которая отвечает за поиск гомологии и вторжение в полосу [14, 15]. Активность BLM по отношению к белку RAD51 зависит от конформации нуклеофиламентов RAD51-ssDNA (одноцепочечной ДНК), которые образуются белком RAD51 в присутствии белка RPA и АТФ. BLM может дестабилизировать нуклеофилы RAD51-ssDNA, если они находятся в неактивной форме, то есть после присоединения к ADP. Когда нуклеофиламенты RAD51-ssDNA находятся в активной форме, после присоединения АТФ BLM стимулирует обмен нитями, осуществляемый RAD51 [16, 17].

Потеря RAD51 и BLM белков может способствовать увеличению числа соматических мутаций и перегруппировок хромосом. Это также способствует аномальной сегрегации хромосом, анеуплоидии, хромосомной нестабильности, чувствительности к повреждающим ДНК агентам и потере гетерозиготности. Все нарушения могут привести к снижению эффективности процессов восстановления ДНК, вызвать геномную нестабильность и, наконец, привести к развитию рака [18]. У пациентов с раком молочной железы снижение количества белка RAD51 наблюдалось в 30% случаев [19], тогда как потеря гетерозиготности наблюдалась в 32% случаев [20]. Риск злокачественной трансформации в клетках с дефицитом BLM в сотни раз больше, чем в клетках, содержащих полностью функциональную BLM-геликазу [21]. С другой стороны, различные варианты естественных полиморфизмов генов, участвующих в репарации ДНК, могут способствовать изменениям эффективности восстановительных процессов, что может привести к развитию рака [5, 22-27].

Тот факт, что белки RAD51 и BLM действуют вместе во время восстановления ДНК путем гомологичной рекомбинации, побудил нас исследовать корреляцию между полиморфными вариантами (SNP) гена RAD51 (c.-61 G> T, rs 1801321 и g.38922 C> G , rs 4417527) и ген BLM (g.96267 A> C, rs 2270132 и g.85394 A> G, rs 2380165) и риск рака молочной железы. Мы также изучили связь между этими полиморфизмами генов RAD51 и BLM и клиническими характеристиками пациентов с раком молочной железы, таких как статус лимфатических узлов, уровень опухоли, гормональные рецепторы (рецепторы эстрогена и прогестерона) и экспрессию рецептора эпидермального фактора роста (HER2).

Образцы крови были получены у 304 женщин (средний возраст 60 лет) со спорадическим раком молочной железы, которые лечились в Отделе хирургической онкологии больницы Н. Коперника (Лодзь, Польша). Клиническая характеристика пациентов с раком молочной железы представлена ​​в таблице 1. Кровь собирали перед хирургическим лечением и химиотерапией. Контрольная группа (319 женщин) состояла из женщин с возрастом, у которых не было диагностировано раковое заболевание, и они были набраны из клиники здравоохранения коммуны в Центре здоровья матери Польши и Института польской мамы (Лодзь, Польша). Местный комитет по этике одобрил исследование, и каждый пациент дал письменное согласие. Таблица 1 Клинические характеристики пациентов с раком молочной железы

Геномную ДНК получали из периферической крови пациентов с раком молочной железы и здоровых людей с использованием коммерческого набора Miniprep для ДНК крови (Axygen Biosciences, CA, США), как рекомендовано производителем.

Мы получили список SNP в генах RAD51 и BLM из общественного достояния Национального центра биотехнологической информации, базы данных о единичных нуклеотидных полиморфизмах (NCBI dbSNP) по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp. Для этого исследования были выбраны полиморфизмы c.-61 G> T (rs1801321) и g.38922G> C (rs4417527) гена RAD51 и g.96267 A> C (rs2270132) и g.85394 A> G (rs2380165 ) полиморфизмы гена BLM с малой частотой аллеля (MAF) 0,467, 0,109, 0,376 и 0,333 в европейской популяции соответственно (идентификатор популяции популяции: HapMap-CEU для всех; http://www.ncbi.nlm.nih.gov / SNP). Праймеры были разработаны в соответствии с опубликованной нуклеотидной последовательностью в базе данных ENSEMBL (идентификатор гена RAD51: ENSG00000051180 и идентификатор гена BLM: ENSG00000197299) и с использованием программного обеспечения Primer3 для c.-61 G> T, g.38922 G> C, g.96267 A> C SNP (http://frodo.wi.mit.edu/) и веб-программным программным обеспечением для g.85394 SNP (http://bioinfo.biotec.or.th/WASP).

Реакцию полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-RFLP) использовали для определения генотипов полиморфизмов c.-61 G> T и g.38922 C> G гена RAD51 и полиморфизма g.96267 A> C BLM. Для определения генотипов g.85394 A> G полиморфизма гена BLM использовали полимеразную цепную реакцию с противолежащими двухпарными праймерами (ПЦР-CTPP).

ПЦР-реакцию проводили в общем объеме реакции 25 мкл, содержащем 50 нг геномной ДНК, ДНК-полимеразы 1 U Biotools (Biotools, Madrid, Spain), 1 × реакционного буфера (750 мМ Трис-HCl (pH 9,0), 500 мМ KCl , 200 мМ (NH4) 2SO4), 0,2 мМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl2 и 0,25 мкМ каждого праймера (Metabion, Martinsried, Germany). Последовательности праймеров представлены в таблице 2. ПЦР-амплификации проводили в термоциклере ДНК-двигателя (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Условия термического циклирования были следующими: начальная стадия денатурации при 95 ° С в течение 5 мин, 34 цикла при 95 ° С в течение 30 с, 30 с при температуре отжига 65 ° С и 60 с при 72 ° С. Табличные 2Primer последовательности c .-61 G> T и g.38922 C> G полиморфизма гена RAD51 и g.96267 A> C и g.85394 A> G полиморфизмов BLM-гена

Продукты полиморфизмов c.-61 G> T и g.38922 C> G гена RAD51 и полиморфизм g.96267 A> C гена BLM расщепляли в течение ночи 0,2 U рестрикционного фермента NgoMIV, NlaIII и StyI (NEB New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США), соответственно. Продукты ПЦР разделяли на 8% полиакриламидный гель, окрашивали бромидом этидия и рассматривали под ультрафиолетовым светом. На рисунке 1 представлены типичные гели из анализа полиморфизмов c.-61 G> T (A) и g.38922 C> G (B) гена RAD51 и g.96267 A> C (C) и g .85394 A> G (D) полиморфизмы BLM-гена. 1Genotypes c.-61 G> T (rs1801321) (a) и g.38922 C> G (rs4417527) (b) полиморфизмы гена RAD51 и g.96267 A> C (rs2270132) (c) и g.85394 A> G (rs2380165) (d) полиморфизмы гена BLM, проанализированного электрофорезом на 8% полиакриламидном геле, окрашенным бромидом этидия и рассматриваемым под ультрафиолетовым светом. Lane M показывает маркер молекулярной массы GeneRuler TM 100 bp; дорожка K на изображении C показывает контроль, содержащий продукт ПЦР без реакции с рестрикционным ферментом StyI; дорожка K на изображении D показывает контроль, содержащий реакционную смесь с пускателями F1 и R1; все остальные полосы представляют генотипы, указанные в верхней части рисунков

Статистический анализ проводился с использованием пакета STATISTICA 8.0 (Statsoft, Tulsa, OK, USA). Распределение генотипов и аллелей между группами было проверено с использованием анализа χ2. Равновесие Харди-Вайнберга проверяли с использованием теста χ2 для сравнения наблюдаемых частот генотипа с ожидаемыми частотами среди случая и контрольных субъектов. Для каждого SNP были рассчитаны коэффициенты шансов (OR) и 95% доверительные интервалы (CI). Логистическая регрессия была оценена связь между генотипом, раком и клиническими параметрами.

Рак молочной железы и контрольные группы были разделены на группы, соответствующие трем генотипам. Распределение генотипов для полиморфизмов c.-61 G> T и g.38922 C> G гена RAD51 согласуется с данными, предсказанными равновесием Харди-Вайнберга (p> 0,05), за исключением того, что в c- 61 G> T для группы пациентов. Это обусловлено очень низким присутствием генотипа G / G полиморфизма c.-61 G> T гена RAD51 у польской популяции. В случае генотипных распределений для g.96267 A> C и g.85394 A> G полиморфизмов гена BLM они значительно отличались от предсказанных равновесием Харди-Вайнберга (p G и генотипа C / C полиморфизма g.96267 A> C гена BLM у польской популяции. Распределение генотипов полиморфных вариантов генов RAD51 и BLM и комбинаций внутригенных и межгенных генотипов для пациентов и контрольных пациентов с раком показано в таблице 3. Таблицы 3. Показатели генотипа и аллели и отношения шансов (OR) c.-61 G> T и g.38922 C> G полиморфизма гена RAD51 и g.85394 A> G и g.96267 A> C полиморфизмов BLM-гена у пациентов с раком молочной железы и контролей

Мы проверили распределение генотипов и частоты аллелей полиморфизмов генов BLM и RAD51 в группах пациентов с различным статусом рецепторов гормонов, пациентов с положительным и отрицательным статусом лимфатических узлов и пациентов с различным уровнем опухоли (таблица 4). Мы не наблюдали никакой связи между статусом рецептора гормона эстрогена и распределением генотипов и частоты аллелей для четырех проанализированных полиморфизмов (данные не показаны). Мы не наблюдали никакой связи между экспрессией HER2 и распределением генотипов и частоты аллелей для любого полиморфизма (данные не показаны). Табл. 4. Генотип, частота аллелей и отношения шансов (OR) полиморфизма c.-61 G> T ген RAD51 и полиморфизм g.96267 A> C гена BLM у пациентов с раком молочной железы с различными клиническими параметрами

Мы не наблюдали никакой корреляции между полиморфизмом g.38922 C> G гена RAD51 и g.85394 A> G и g.96267 A> C полиморфизмами статуса BLM и статуса лимфатических узлов (данные не показаны).

Следующим анализируемым клиническим признаком был уровень опухоли, описанный системой классификации Блума-Ричардсона (таблица 4). Мы не обнаружили никакой связи между полиморфизмами c.-61 G> T и g.38922 C> G гена RAD51 и полиморфизмом g.85394 A> G гена BLM и класса опухоли (данные не показаны).

RAD51 рекомбиназа и BLM-геликаза являются элементами белкового оборудования, выполняющего восстановление ДНК-DSB путем гомологичной рекомбинации [15]. Гомологичная рекомбинация инициируется комплексом MRN (MRE11, RAD50, NBN), который режется на концах DSB, чтобы генерировать 3 ‘выступы, фланкирующие участок разлома. Полученные концы ssDNA сначала защищены RPA, прежде чем в конечном итоге будут покрыты белком RAD51 с образованием критической нуклеопротеиновой нити, необходимой для точного ремонта [11]. BLM-геликаза была идентифицирована в большом комплексе наблюдения за повреждением ДНК с комплексом BRCA1 и MRN [28] и, как было показано, ассоциируется со многими гомологичными рекомбинационными белками, такими как топоизомераза III, BLAP75 / RMI1 и RAD51 [29]. Клеточные и биохимические исследования привели к мнению о том, что BLM обладает как про-, так и анти-рекомбиногенными функциями. Наиболее примечательно, что BLM имеет важное значение для стабилизации поврежденных репликационных вилок и подавления аберрантных событий рекомбинации, о чем свидетельствует резкое увеличение уровней сестринских обменов хроматидами (SCE) и потеря гетерозиготности в нулевых клетках BLM. Напротив, BLM также предсказано, чтобы способствовать гомологичной рекомбинации путем облегчения экзонуклеолитической резекции DSB, стимулируя синтез-зависимый отжиг нитей и способствуя непересекающему разрешению соединений Holliday [30]. Недавно было показано, что SUMOилирование BLM может влиять на его взаимодействие с RAD51. Сумоилирование BLM облегчает восстановление поврежденных репликационных вилок путем гомологичной рекомбинации путем модуляции вербовки RAD51 или удержания на участках ремонта [31].

Дефекты в некоторых генах репарации ДНК связаны с раковыми заболеваниями, связанными с раком человека, такими как синдром Блума, вызванный мутацией гена BLM, телеангиэктазии атаксии и синдромом Вернера. Помимо этих редких синдромов, дефицитный ремонт ДНК предлагается как предрасполагающий фактор в семейном раке молочной железы и в некоторых спорадических раковых опухолях молочной железы [3-6]. Достижения в занижении генетических предрасположенностей к раку молочной железы также были сделаны путем скрининга встречающихся в природе полиморфизмов в генах репарации ДНК [5, 22-27]. Эти исследования показали, что тонкие дефекты в способности репарации ДНК, возникающие из генов с низкой проникающей способностью или их комбинаций, модифицируются другими генетически определенными или экологическими факторами и коррелируют с риском рака молочной железы.

В настоящем исследовании мы сопоставляли генетическое строение пациентов с раком молочной железы, выраженное полиморфными вариантами двух важных гомологичных рекомбинационных генов BLM и RAD51 с клиническими параметрами пациентов, включая состояние лимфатических узлов, уровень опухоли, гормональные рецепторы (рецепторы эстрогена и прогестерона) и экспрессию рецептора 2 эпидермального фактора роста (HER2). Полиморфизм c.-61 G> T-RAD51 расположен в 5′-нетранслируемой области, регуляторном промоторном элементе гена RAD51. Это может повлиять на эффективность трансляции и устойчивость к мРНК, что приводит к изменениям уровней белка RAD51, что, в свою очередь, может влиять на активность мультипротеинового комплекса восстановления ДНК, который включает BRCA1, BRCA2 и RAD51, и приводит к восприимчивости к раку молочной железы. Полиморфизм g.38922 C> G-RAD51 расположен в интроне 10 в гене RAD51. Интрон 10 расположен между экзонами в основном консервативном домене, который включает мотивы Walker A и B, которые имеют функцию связывания АТФ и активности гидролиза. Из-за локализации интрона g.38922 C> G полиморфизм не влияет на кодирование аминокислот и, следовательно, вероятно, напрямую не влияет на функцию белка, но, вероятно, он может играть роль в правильном распознавании некодирующего элемента сплайсинга РНК и таким образом, он может косвенно отвечать за правильное функционирование белка RAD51. В свою очередь, это может повлиять на активность мультипротеинового комплекса восстановления ДНК, который включает BRCA1, BRCA2, RAD51 и другие белки. С другой стороны, наблюдаемые ассоциации между риском рака молочной железы и полиморфизмом g.38922 C> G-RAD51 можно интерпретировать как влияющие на процесс созревания мРНК и, как следствие, активность белка RAD51.

Помимо генотипов, экспрессия генов или белков может также играть роль в риске рака молочной железы. Сверхэкспрессия RAD51 была связана с более высоким риском рецидива и смерти локорегиона. Сверхэкспрессия RAD51 также значительно ассоциировалась с более коротким выживанием и общей выживаемостью безрецидивной регрессии [32]. Кроме того, было показано, что уровни мРНК RAD51 обратно пропорционально связаны с статусом PR, а наивысшие уровни были обнаружены в ER-позитивных / PR-негативных опухолях. Анализ данных экспрессии микрочипов из 295 случаев рака молочной железы указывает на то, что экспрессия RAD51 с экспрессией мРНК связана с более высоким риском рецидива опухоли, отдаленными метастазами и наихудшей общей выживаемостью [33].

Полиморфизм g.96267 A> C расположен в интроне 20, а полиморфизм g.85394 A> G расположен в интроне 17 гена BLM. Эти интроны разделяют экзоны, образуя эволюционно сохранившийся RecQ-подобный домен. Этот домен обладает высокой степенью гомологии с белком RecQ E. coli. RecQ-подобный домен и его составные поддомены ответственны за наиболее важные функции BLM-геликазы [34]. Полиморфный вариант g.96267 A> C расположен в интроне 20, который отделяет экзоны, кодирующие домен HRDC (helicase и RNase D-подобный C-терминальный домен), который в семействе Helicase RecQ играет роль в распознавании и связывающих субстратов и белково-белковых взаимодействий. В случае геликсазы BLM домен HRDC также участвует в процессе движения и развития структуры Холлидея. Поэтому вполне вероятно, что полиморфные варианты гена BLM g.96267 A> C и g.85394 A> G могут играть важную роль в надлежащем распознавании и вырезании интронов в процессе созревания мРНК и могут отвечать за правильное функционирование BLM-геликазы.

Наши результаты по полиморфизму генов и рискам рака молочной железы частично согласуются с исследованием, представленным Ding et al. [26]. Сравнивая результаты Ding et al. проведенных по популяции женщин, живущих на Тайване, к нашим результатам мы одинаково наблюдали защитную роль варианта A / C в случае полиморфизма A.9 CG.96267 гена BLM (таблица 3). С другой стороны, наши результаты не согласуются с результатами Ding et al. в случае генотипа C / C полиморфизма g.38922 C> G гена RAD51 (таблица 3).

Было показано, что полиморфный вариант гена BLM — rs2380165 и варианты гена RAD51 — rs4417527 и rs2412546 связаны с риском рака молочной железы [26]. Более того, не только интронные полиморфизмы, расположенные в области, кодирующей геликазный домен BLM, но также и в области кодирования домена RAD51-взаимодействия, показали взаимодействие с полиморфизмами RAD51 при определении восприимчивости к раку молочной железы. Недавно было также показано, что области, ответственные за партнерство RAD51, совпадают с доменами, ответственными за связывание ssDNA, BLM100-214 и BLM1317-1367 [29]. Это говорит о том, что способность BLM подавлять гомологичную рекомбинацию может включать как смещение RAD51 из D-петли, так и связывание BLM с недавно высвобожденной ssDNA для восстановления дуплекса и полностью препятствовать генетическому обмену посредством гомологичной рекомбинации.

В настоящем исследовании мы также сопоставили комбинации генотипов четырех полиморфных вариантов генов BLM и RAD51 с появлением рака молочной железы (таблица 3). В частности, в случае анализа комбинаций генотипов интергена и возникновения рака молочной железы мы обнаружили высокий риск развития рака (таблица 3).

Взаимосвязь между полиморфизмами c.-61 G> T и g.38922 C> G гена RAD51 и полиморфизмами g.91266 C> A и g.85394 A> G гена BLM и клиническими характеристиками пациентов с раком молочной железы (табл. 4). Рак молочной железы были разделены на группы в зависимости от статуса лимфатических узлов, степени опухоли и экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона (ER и PR) и статуса рецептора HER2. Статус вспомогательного лимфатического узла и размер опухоли являются клиническими параметрами, напрямую связанными с периодом выживания при раке молочной железы. Уровень экспрессии ER и PR являются полезными прогностическими маркерами, позволяющими оценивать реакцию на эндокринную терапию. ER- и PR-позитивные опухоли могут иметь от 6 до 7-более высокий показатель ответа на негативы [35].

Следующим анализируемым клиническим признаком было присутствие HER2 (C-ERB / ​​neu), принадлежащего к группе онкогенов функции тирозинкиназы, которая сверхэкспрессируется примерно на 20-30% от рака молочной железы и часто ассоциируется с резистентностью к гормональной терапии. Активация этого рецептора приводит к неконтролируемому делению раковых клеток, что может сопровождаться увеличением количества фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в качестве основного фактора, вызывающего образование новых кровеносных сосудов в опухоли. Сверхэкспрессия HER2 приводит к ранним метастазам в направлении лимфатических узлов, ранним рецидивам заболевания и связана с более короткой выживаемостью и худшим клиническим прогнозом [36]. Мы не наблюдали никакой связи между экспрессией HER2 и распределением генотипов и частоты аллелей в любом анализируемом полиморфизме (данные не показаны).

Мы также сопоставили генотипы полиморфных вариантов BLM и RAD51 с уровнем опухоли, описанным системой классификации Блума-Ричардсона (таблица 4). Это трехступенчатая шкала, согласно которой образцы опухоли, взятые во время биопсии, классифицируются, а затем анализируются с помощью микроскопа. К категории G1 относятся опухоли, чьи клетки малы, имеют правильные формы, демонстрируют высокое сходство в структурных терминах с нормальными клетками молочной железы, а их митотический индекс не превышает число седьмых. К категории G2 относятся опухоли, чьи клетки проявляют видимые изменения по сравнению с нормальными клетками молочной железы, а их митотический индекс колеблется от 8 до 14. К последней категории G3 относятся опухоли, чьи клетки крупные и имеют неправильную форму. Они значительно отличаются от нормальных клеток, быстро делятся — их митотический индекс превышает число 15.

Полученные результаты показывают, что полиморфизм генов RAD51 и BLM может быть связан с риском рака молочной железы. Связь может быть подчеркнута общим взаимодействием между этими генами. Мы показали, что полиморфизм c.-61 G> T гена RAD51 может модулировать риск рака молочной железы и быть связан с экспрессией рецептора прогестерона и локальными метастазами. Мы также обнаружили связь между полиморфизмом g.96267 A> C-BLM и опухолью G3.

Изменчивость генов RAD51 и BLM может играть роль в возникновении рака молочной железы. Обследованные полиморфизмы генов RAD51 и BLM не могут быть независимыми маркерами рака молочной железы, но наши исследования могут быть полезны при создании набора клинических и молекулярных маркеров, полезных для диагностики рака молочной железы.

Эта работа была поддержана грантом N N301 289237 Министерства науки и высшего образования.

источник

«для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития рака молочной железы, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени . »

по применению набора реагентов

для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с

риском развития рака молочной железы,

методом полимеразной цепной реакции

в режиме реального времени

Регистрационное удостоверение МЗ СР РФ

ВНИМАНИЕ! Изучите инструкцию перед началом работы

3. Аналитические характеристики……………………………………………… 5

3.1. Специфичность анализа……………………………………………… 5

3.2. Чувствительность анализа…………………………………………… 5

4. Требования к помещениям и организации работ…………………… 6

6. Оборудование и материалы……………………………………………………… 6

8. Проведение полимеразной цепной реакции…………………………… 7

9. Регистрация результатов с использованием детектирующих амплификаторов ДТ–322 и ДТ–96…………………………………………… 9

10. Условия транспортирования, хранения и эксплуатации комплектов…………………………………………………………………………………. 11 Приложение. Работа с программным обеспечением перед запуском программы амплификации…………………………… 12

1. Добавление нового теста………………………………………………………… 12

2. Создание протокола с использованием параметра «Тест»…… 16

3. Улучшение визуализации и корректировка результатов……… 16 ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития рака молочной железы, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ОнкоГенетика BRCA

1.1. Набор реагентов ОнкоГенетика BRCA предназначен для определения для определения аллельных вариантов генов BRCA1 и BRCA2 человека (полиморфизмы 185delAG, 4153delA, 5382insC, 617 delT) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени в препаратах ДНК человека, полученных из периферической крови .

1.2. Комплекты реагентов могут быть использованы в клинико– диагностических лабораториях медицинских учреждений и научно–исследовательской практике .

2.1. Принцип действия В основе работы комплектов реагентов лежит принцип амплификации ДНК методом ПЦР. Процесс амплификации заключается в серии повторяющихся циклов температурной денатурации ДНК, отжига праймеров (затравок) комплементарных специфическому участку ДНК и последующей достройке полинуклеотидных цепей ДНК–полимеразой .

В смесь для амплификации введены сигнальный зонды, содержащие флуоресцентные метки FAM и HEX, на каждый вариант определяемого генетического полиморфизма. После окончания ПЦР проводится раунд температурного плавления сигнальных зондов, в результате чего изменяется уровень флуоресценции, который фиксируется и представляется программным обеспечением прибора в виде графика. Если сигнальный зонд частично комплементарен ДНК–мишени, температура его плавления будет отличаться от температуры плавления полностью комплементарного зонда. На основании температуры плавления сигнальных зондов проводится интерпретация результатов анализа .

3.1. Специфичность анализа В образцах биологического материала человека после завершения реакции амплификации должен определяться генотип исследуемого образца .

Анализируемые участки ДНК находятся в генах, встречающихся не только у человека. Набор реагентов ОнкоГенетика BRCA может регистрировать положительный результат (генотип исследуемого образца) в случае попадания в реакционную пробирку ДНК любых других организмов, содержащих аналогичную последовательность .

3.2. Чувствительность анализа Количество анализируемой ДНК должно быть не менее 1,0 нг на амплификационную пробирку. При использовании меньшего количество ДНК производитель не гарантирует адекватную работу комплекта .

В образцах с недостаточным количеством ДНК после завершения реакции амплификации регистрируется сомнительный результат .

Примечание. Для оценки количества выделенной ДНК рекомендуется использовать набор реагентов для контроля взятия материала методом ПЦР (КВМ) (ООО «НПО ДНК–Технология») .

Требования к помещениям и организации работ должны соответствовать Методическим указаниям МУ 1.3.2569–09 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III–IV групп патогенности» .

Требования к проведению работ с патогенными микроорганизмами изложены в санитарных правилах СП 1.3.2322– 08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» .

5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Мерами предосторожности при работе с набором реагентов является соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно–эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.) .

Анализируемым материалом являются препараты ДНК человека, полученные из цельной периферической крови .

Взятие цельной периферической крови. Взятие цельной периферической крови проводится в пластиковые пробирки объёмом 2,5 мл или 4,0 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2 мг/мл. В качестве антикоагулянта допускается также использование цитрата натрия .

Для перемешивания содержимого пробирку переворачивают 2–3 раза после взятия материала .

ВНИМАНИЕ! Не допускается использование гепарина в качестве антикоагулянта .

Хранение образцов цельной периферической крови .

Допускается хранение образцов при температуре 2–8 °С не более 24 ч .

Выделение ДНК. Для получения ДНК из цельной периферической крови рекомендуется использовать комплект реагентов для выделения ДНК ПРОБА–ГС–ГЕНЕТИКА или ПРОБА– РАПИД–ГЕНЕТИКА (производства ООО «НПО ДНК–Технология») .

Комплект ПРОБА–ГС–ГЕНЕТИКА рекомендуется использовать в случае, если предполагается длительное хранение выделенной ДНК (до 6 месяцев) .

ДНК, полученная с использованием комплекта ПРОБА– РАПИД–ГЕНЕТИКА, хранится не более 1 месяца .

ВНИМАНИЕ! Одновременно с исследованием неизвестных образцов провести исследование отрицательного контрольного образца, прошедшего этап выделения ДНК (см. Инструкции к комплектам реагентов для выделения ДНК ПРОБА–ГС–ГЕНЕТИКА и ПРОБА– РАПИД–ГЕНЕТИКА) .

Для определения аллельных вариантов генов BRCA1 и BRCA2 человека для каждого полиморфизма (185delAG, 4153delA, 5382insC, 617 delT) необходимо применять соответствующую смесь для амплификации .

8.1. Промаркировать необходимое количество пробирок для амплификации объёмом 0,2 мл (количество анализируемых образцов, умноженное на количество определяемых генетических полиморфизмов; а также пробирку для отрицательного контрольного образца «К-», пробирки для положительных контрольных образцов – «К+1», «К+2».) .

8.2. Встряхнуть пробирки со смесью для амплификации в течение 3–5 с и центрифугировать в течение 1–3 с на микроцентрифуге/вортексе .

8.3. Внести в промаркированные пробирки по 20 мкл соответствующей смеси для амплификации (для каждого полиморфизма отдельно) .

8.4. Встряхнуть пробирки с ПЦР–буфером и Taq–AT полимеразой в течение 3–5 с и центрифугировать в течение 1–3 с на микроцентрифуге/вортексе .

Внимание! Taq–AT полимеразу доставать из морозильной камеры непосредственно перед использованием .

8.5. Приготовить в отдельной пробирке смесь ПЦР–буфера и

Taq–AT полимеразы:

10 (N+1) мкл ПЦР–буфера, 0,5 (N+1) мкл Taq–AT полимеразы, где N – количество промаркированных пробирок (п.8.1.) с запасом на 1 образец .

Закрыть крышку пробирки, встряхнуть пробирку в течение 3–5 с и центрифугировать в течение 1–3 с на микроцентрифуге/вортексе .

ВНИМАНИЕ! Смесь ПЦР–буфера и Taq–AT полимеразы готовить непосредственно перед использованием, не допускается её хранение .

8.6. Добавить в каждую пробирку со смесью для амплификации (п.8.3.) по 10 мкл смеси ПЦР–буфера и Taq–AT полимеразы .

8.7. Добавить в каждую пробирку по одной капле (20 мкл) минерального масла, закрыть крышки пробирок .

8.8. Добавить в соответствующие пробирки по 5,0 мкл анализируемого препарата ДНК (кроме пробирок «К-», «К+1» и «К+2»), закрыть крышки пробирок .

ВНИМАНИЕ! Во избежание контаминации следует вносить образцы ДНК наконечниками с аэрозольными барьерами .

8.9. Добавить в пробирку «К-» 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего этап выделения ДНК, а в пробирки, промаркированные «К+1», «К+2» внести по 5,0 мкл соответствующих положительных контрольных образцов, закрыть крышки пробирок .

8.10. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге/вортексе в течение 1–3 с .

8.11. Установить пробирки в блок детектирующего амплификатора .

8.12. Заполнить протокол (с использованием соответствующего параметра «Теста» для каждого определяемого полиморфизма) в программном обеспечении к прибору .

Примечание. Если определение данного генетического полиморфизма выполняется в первый раз, необходимо создать для него соответствующий «Тест». Если «Тест» для определения данного генетического полиморфизма уже существует, следует сразу перейти к заполнению протокола (см. Приложение, п.2.) .

8.13. Закрыть блок детектирующего амплификатора и запустить программу .

Продукты амплификации можно хранить при температуре 2–8 °С в течение 24 ч .

АМПЛИФИКАТОРОВ ДТ–322 И ДТ–96

9.1. Учёт результатов ПЦР осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с детектирующим амплификатором .

9.2. В образцах ДНК, прошедших ПЦР, программа определяет генотип исследуемого образца, который отображён в таблице (рисунок 1) в графе «Анализ мутаций» .

Интерпретацию результатов необходимо проконтролировать с помощью визуального анализа кривых плавления и откорректировать результаты (см. Приложение, п.3.) .

Рисунок 1. Таблица результатов анализа ВНИМАНИЕ! После корректировки результатов полученные температурные пики не должны отличаться от заданных более чем на 1,5 °С .

Различия более чем на 1,5 °С могут свидетельствовать об ошибках при проведении ПЦР (раскапывании смечи для амплификации другого полиморфизма, неправильном задании теста, некорректной расстановки пробирок в матрицу термоблока прибора и др.) .

Температурные пики должны соответствовать условиям:

гомозигота, определяемая по Tm, °С FAM Tm, °С HEX каналу FAM:

гомозигота, определяемая по каналу HEX:

гетерозигота: Tm, °С FAM Tm, °С HEX Полученные экспериментальные параметры анализа полиморфизмов следует ввести в параметры «Теста» для данного полиморфизма (см. Приложение) .

9.3. Программа определяет сомнительный результат в следующих случаях:

в образцах, не прошедших ПЦР;

в образцах с недостаточным количеством ДНК;

при значительных отличиях полученной температуры плавления продуктов амплификации от заданной .

Следует повторить ПЦР для подобных образцов .

9.4. В отрицательных контрольных образцах должен регистрироваться сомнительный результат. При получении положительного результата (определение генотипа) для отрицательных контрольных образцов «К-», результаты всей постановочной серии бракуют .

10.1. Срок годности комплектов – 6 месяцев с даты изготовления .

10.2. Смесь для амплификации, ПЦР–буфер и минеральное масло хранить при температуре 2–8 °С в течение всего срока годности .

10.3. Taq–AT полимеразу хранить при температуре минус 20 °С в течение всего срока годности .

10.4. Транспортирование комплектов осуществляют всеми видами крытого транспорта при температурах, соответствующих условиям хранения комплектов реагентов, входящих в состав набора .

10.5. Комплект с истекшим сроком годности применению не подлежит .

10.6. Для получения надёжных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора .

10.7. Предприятие–изготовитель гарантирует соответствие набора требованиям технических условий при соблюдении условий транспортировки, хранения и применения, установленных техническими условиями .

По вопросам, касающимся набора реагентов для определения генетических полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ОнкоГенетика BRCA, следует обращаться в ООО «НПО ДНК–Технология» по адресу:

117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, корп.6, этаж 11 Тел./факс + 7 (495) 980-45-55 Е-mail: mail@dna-technology.ru www.dna-technology.ru

* – при создании блока 5 отметить его тип как «Кривая плавления»

(рисунок 4, в таблице появится дополнительный параметр «t oC»

Рисунок 3. Фрагмент окна «Редактор программ амплификации» при заполнении блока №5 .

Ввести в графу «Температура °C» значение «25» (рис. 5) .

Для заполнения параметров кривой плавления нажать на (блок №5 в графе «t oC) .

поле В открывшемся окне «Кривая плавления» установить парамаетры t=1,0 oС, Tкон=75 °С и нажать кнопку «ОК» .

Рисунок 4. Фрагмент окна «Редактор программ амплификации» при заполнении блока №5 .

Рисунок 5. Вид окна «Кривая плавления» .

1.4. Создать многотестовый режим тест «BRCA»:

выбрать в меню «Тест» пункт «Создать/редактировать», создать тест «BRCA», отметить много тестовый режим;

редактировать тест «BRCA», в окне редактирования выбрать тесты «BRCA_185delAG», «BRCA_4153delA», «BRCA_5382insC», «BRCA_6174delT» и нажать кнопку «ОК» .

2.1. На вкладке «Протокол» окна программы нажать кнопку «Добавить тест» .

2.2. В открывшемся окне «Добавить тест» выбрать из списка необходимый тест, ввести количество анализируемых образцов в строке «Количество» пункта «Образцы», нажать кнопку «ОК» .

2.3. Отметить расположение пробирок на матрице термоблока (снять галочку «Автозаполнение», нажать «Очистить поле матрицы», нажать «Порядок заполнения») .

ВНИМАНИЕ! Расположение пробирок на матрице термоблока должно строго соответствовать порядку установки пробирок в блоке (п.8.12.) .

2.4. Заполнить поле «Идентификатор» таблицы, согласно анализируемым образцам .

2.5. При использовании нескольких тестов в одном протоколе повторить пункты 2.1. – 2.4 .

2.6. Нажать кнопку «Применить» на вкладке «Протокол» .

ВНИМАНИЕ! В открывшейся вкладке «Запуск программы амплификации должна быть отражена программа амплификации, приведённая в таблице 2 .

2.7. При необходимости заполнить поле «Комментарий» на вкладке «Запуск программы амплификации» .

2.8. Закрыть блок детектирующего амплификатора и нажать кнопку «Запуск программы» .

Для лучшей визуализации результатов необходимо скорректировать цветовую гамму пробирок в термоблоке .

Для этого следует открыть инструментальную панель (кнопка ), нажать «Анализ полиморфизмов, плавление» (кнопка ), выбрать «Цветовая гамма пробирок» (кнопка ) .

Образцы, гомозиготные по полиморфизму, определяемому каналом FAM, будут автоматически покрашены в синий цвет;

гетерозиготные – в красный; сомнительные – в жёлтый .

Рисунок 7. Корректировка значений температурных пиков кривых плавления .

После корректировки «Температурных баров»

экспериментальную температуру плавления можно увидеть в окне «Параметры анализа» (вызывается кнопкой ), в пункте 5 «Параметры анализа полиморфизма» .

Рисунок 8. Экспериментальная температура плавления Полученные экспериментальные параметры анализа полиморфизмов следует ввести в параметры «Тест» для данного полиморфизма (см. п.1.2.).Корректированные температурные параметры будут автоматически использоваться при дальнейших исследованиях изучаемого полиморфизма на данном детектирующем амплификаторе.

«ИЗУЧЕНИЯ ГОТОВНОСТИ СТУДЕНТОВ-БУДУЩИХ ПСИХОЛОГОВ К УПРАВЛЕНИЮ КОНФЛИКТАМИ В УЧЕНИЧЕСКОМ КОЛЛЕКТИВЕ Ефремов Д. В. Шалагинова К. С. Тульский государственный педагогический университет имени. »

«Адаптация первоклассников к школе Адаптация к школе это процесс привыкания к новым школьным условиям, который каждый первоклассник переживает и осознает по-своему. Большинство первоклассников приходят в школу из детского сада. Там были игры, прогулки, спокойный режим, дневной сон, всегда рядыш. »

«Рабочая программа Окружающий мир 3 класс (новая редакция) Рабочая программа составлена на основе программы » Окружающий мир» ( А.А. Вахрушев, Д.Д. Данилов, А.С. Раутиан, С.В.Тырин 2011год ) Составитель: (учителя начальных классов Филатова А.А. Панкратова Т.А выс. »

«Н.А. Вагина ФУНКЦИИ МУЗЫКИ В ВОСПИТАНИИ И РАЗВИТИИ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА В статье обосновывается необходимость использования всех педагогических резервов для духовного и физического становления личности ребёнка. Анализ функций музыкального искусства позволяет рассматривать проблему полифункционального подхода к музыкальному воспитанию с то. »

«Вестник образования, науки и техники. Серия «Образование». Том 17. 2015 г. ББК 74 УДК 061.3, 37 В сборник включены избранные тезисы докладов участников всероссийских научно-практических конференций, проводимых ООО «НПЦ «ИНТЕРТЕХИНФОРМ» в период c 16 ноября 2015 года по 15 декабря 2015 года. Рассматриваются вопросы обобщения и распространения оп. »

«Министерство культуры Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Московский государственный институт культуры Факультет музыкального искусства Кафедра музыкального образования «УТВЕРЖДАЮ» «УТВЕРЖДАЮ» Зор. »

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» (НИУ «БелГУ) РАБОЧАЯ ПРОГРАММА. »

«Пояснительная записка Школа и детский сад нацелена на реализацию комплекса образовательных задач, которые исходят из двух взаимодействующих целей – подготовить ребёнка дошкольного возраста к обучению в школе и. »

2018 www.fi.z-pdf.ru — «Библиотека бесплатных материалов — собрание материалов»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 2-3 рабочих дней удалим его.

источник