Оценка уровня активности топоизомеразы 2а при раке молочной железы

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему: Молекулярные маркеры эффективности предоперационной химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы

Автореферат диссертации по медицине на тему Молекулярные маркеры эффективности предоперационной химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы

КЛИМЕНКО Вероника Викторовна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕДОПЕРАЦИОННОЙ ХИМИОТЕРАПИИ МЕСТНО-РАСПРОСТРАНЕННОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.12- онкология 03.01.04- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

доктор медицинских наук Татьяна Юрьевна Семиглазова, ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий научным отделом — ведущий научный сотрудник отдела инновационных методов и терапевтической онкологии и реабилитации

доктор медицинских наук, профессор Евгений Наумович Имянитов, ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий научным отделом биологии опухолевого роста

доктор медицинских наук, профессор Орлова Рашида Вахидовна, «Санкт-Петербургский Государственный университет» Правительства Российской Федерации, заведующая кафедрой онкологии медицинского факультета

доктор медицинских наук, профессор Денисенко Александр Дорофеевич, ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», руководитель отдела биохимии

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону

Защита диссертации состоится 22 сентября 2015 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета при ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» МЗ РФ по адресу: 197758, Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» МЗ РФ (197758, Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68) и на сайте http://mvw.iiiioncologii.ru/ru/notle/284

Автореферат разослан « » июля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Елена Вилльевна Бахидзе

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Местно-распространенный рак молочной железы (cTl-2N2-3M0, cT3Nl-ЗМО, CT4N0-3M0) отличается высокими показателями заболеваемости и смертности. Главными задачами предоперационной (неоадъювантной) химиотерапии данной категории больных являются: увеличение удельного веса органосохра-няющих операций, ранняя оценка эффективности выбранного режима системного лечения, уточнение долгосрочного прогноза в зависимости от степени па-томорфологического ответа опухоли на лечение. Благодаря прогрессу молеку-лярно-генетических исследований все большее признание получает представление о гетерогенности и патогенетическом многообразии рака молочной железы (РМЖ). Выбор лекарственного лечения, которое ответило бы всем этим критериям, представляет одну из актуальных проблем терапии больных местно-распространенным РМЖ [Семиглазов В.Ф., 2015].

Препаратами выбора в химиотерапии РМЖ по-прежнему остаются антра-циклиновые антибиотики и таксаны [Cardoso F., 2014; Орлова Р.В., 2015; Spara-no J.A., 2015]. В работах in vivo угнетение экспрессии тоиоизомеразы II альфа приводит к значительному снижению чувствительности опухоли к антрацикли-новым антибиотикам [Susini Т., 2014; Bria Е., 2015]. Повышение экспрессии белка бета-тубулина III класса считается важным звеном в механизме развития резистентности к таксанам [Bernard-Marty С., 2002; English D., 2013]. Все большую значимость приобретает изучение мутации гена BRCA1, которая ассоциируется с высокой пенетрантностью и наследственной предрасположенностью РМЖ [Imyanitov E.N., 2004; 2014]. В литературе данные о предиктивном и прогностическом значении экспрессии генов топоизомеразы II альфа, бета-тубулина III класса и мутации гена BRCA1 разноречивы.

Знание молекулярных характеристик опухоли может улучшить раннюю оценку эффективности выбранного режима лечения [Проценко С.А., 2012], а также уточнить долгосрочный прогноз заболевания в зависимости от степени патоморфологического ответа опухоли на терапию.

Улучшить результаты лечения больных местно-распространенным раком молочной железы.

1. В рамках рандомизированного исследования оценить непосредственные результаты сравниваемых схем неоадъювантной терапии больных местно-распространенным РМЖ:

— объективный клинический ответ посредством физикального метода, маммографии, ультразвукового исследования с соноэластографией и маммосцинтиграфии;

— патоморфологический ответ первичной опухоли по Miller-Payne и степень регресса регионарных метастазов в лимфатических узлах.

2. Оценить предиктивную значимость молекулярных маркеров (экспрессии генов топоизомеразы II альфа и бета-тубулина III класса, а также мутации гена BRCA1) в оценке полного патоморфологического ответа (pCR или ypTONO).

3. Определить чувствительность, специфичность, диагностическую точность, предсказательную ценность положительного и отрицательного результатов достижения полного патоморфологического регресса (pCR) с помощью полуколичественной полимеразной цепной реакции в реальном времени экспрессии генов топоизомеразы II альфа и бета-тубулинов III класса.

4. Проанализировать ежегодные показатели выживаемости без «событий» (event-free survival, EFS) в зависимости от молекулярных маркеров, клинических, морфологических и биологических особенностей рака молочной железы.

Научная новизна исследования

1. На основании анализа базы данных НИИ онкологии им. H.H. Петрова, включающей сведения более чем о 2000 больных РМЖ, проходивших лечение с 2010 по 2014 гг., получена детальная информация о 141 пациент-

ке, получавших в соответствии с рандомизацией неоадъювантную химиотерапию по схеме TAC в сравнении со схемой ТС.

2. В рамках рандомизированного неоадъювантного исследования определены чувствительность, специфичность, диагностическая точность, предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов достижения полного патоморфологического регресса опухоли (ypTONO) с помощью полуколичественной полимеразной цепной реакции в реальном времени детекции экспрессии генов топоизомеразы II альфа и бета-тубулинов III класса.

3. Выполнена оценка предиктивной и прогностической значимости высокой экспрессии гена топоизомеразы II альфа, а также низкой экспрессии генов бета-тубулинов III класса и мутации BRCA1.

Практическая значимость Детекция высокой экспрессии гена топоизомераза II альфа, а также низкой экспрессии генов бета-тубулинов III класса и мутации BRCA1 методом полуколичественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с учётом клинических, морфологических и биологических особенностей местно-распространённого РМЖ в клинической практике позволит: улучшить планирование лекарственной неоадъювантной терапии, индивидуализировать системное лечение, увеличить показатели выживаемости больных, сократить затраты на терапию за счет отказа от использования неэффективных дорогостоящих лекарственных средств.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение неоадъювантной цитотоксической химиотерапии по схеме TAC (доцетаксел + адриабластин + циклофосфамид) чаще, чем по схеме ТС (доцетаксел + циклофосфамид) приводит к объективному клиническому ответу и полному патоморфологическому ответу, особенно при HER2 позитивном и трижды-негативном подтипах РМЖ.

2. При планировании системного лечения целесообразно определение биологического подтипа рака молочной железы, а также маркеров чувстви-

тельности к лекарственной терапии, включающей антрациклиновые антибиотики и таксаны.

3. Уровень экспрессии генов топоизомераза II альфа и бета-тубулина III класса, а также мутационный статус гена BRCA1, могут применяться при выборе тактики предоперационного лечения с учетом клинических, морфологических и биологических особенностей местно-распространенного рака молочной железы.

Материалы и основные положения исследования доложены на IV Международном Молодёжном Медицинском Конгрессе (СПб, 2013); XVIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2014); LXXV Научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины — 2015» (СПб, 2015), «Конкурсе молодых учёных — 2015» (СПб, 2015), I Российском онкологическом научно-образовательном форуме с международным участием «Белые ночи — 2015» (СПб, 2015).

Внедрение результатов работы в практику Результаты исследования нашли отражение в научных работах, внедрены и используются в практической и научно-исследовательской работе ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России, в Санкт-Петербургском ГУЗ «Городском клиническом онкологическом диспансере», в учебном процессе кафедр онкологии ГБОУ ВПО «Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России и ГБОУ ВПО «Северо-Западного государственного медицинского университета им. акад. И.И. Мечникова» Минздрава России.

По материалам исследования опубликовано: 14 печатных работ, в том числе — 10 в отечественной и 1 в зарубежной печати, включая 4 работы в журналах, рецензируемых ВАК.

Личный вклад соискателя состоит в участии на всех этапах проведения

исследования и непосредственном участии в получении исходных данных, в том числе в разработке дизайна исследования. Автор освоил представленные методики и самостоятельно вела больных. Работала в архиве с документами и микропрепаратами (стекла и блоки) в патологоанатомическом отделении НИИ онкологии им. H.H. Петрова Минздрава России. Совместно с опытным морфологом оценивала биологические особенности опухоли.

Объем н структура диссертации Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала, результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций. Работа содержит 25 таблиц, иллюстрирована 53 рисунками. Библиографический указатель включает 50 отечественных и 151 зарубежный источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для настоящего исследования послужили данные историй болезни и сведения из амбулаторных карт 141 больной местно-распространённым РМЖ (средний возраст 49,1+10,8), которые проходили лечение в ФГБУ «НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова» Минздрава России с 2010 по 2014 гг. Медиана наблюдения за больными составила 2,7 года (8— 54 мес). После рандомизации больные получали неоадъювантную химиотерапию по схемам «TAC» (доцетаксел + адриабластин + циклофосфамид) либо «ТС» (доцетаксел + циклофосфамид) до 4-6 циклов. Обе группы больных сопоставимы по клиническим, патоморфологическим и биологическим характеристикам (табл. 1, 2). При НЕ112-положительном раке молочной железы одновременно с химиотерапией назначалась таргетная терапия трастузумабом в стандартных дозах.

Таблица 1 — Характеристика больных местно-распространенным РМЖ с учетом «биологических» подтипов

Биологический подтип Общая группа (п=141) ТАС (п= 82) ТС (п= 59) Р

п % 95% ДИ п % 95%ДИ п % 95% ДИ

Люминальный А 59 41,8 33,8-50,1 32 39,0 28,7-49,9 27 45,8 33,1-58,7 0,43

Люминальный В 30 21,3 14,9-28,5 19 23,2 14,6-33,0 11 18,6 9,7-29,7 0,51

НЕЯ2-позитивный 21 14,9 9,5-21,3 13 15,9 8,7-24,6 8 13,6 6,0-23,6 0,70

Трижды негативный 31 22,0 15,5-29,2 18 22,0 13,6-31,6 13 22,0 12,3-33,7 0,99

Таблица 2 — Характеристика больных местно-распространенным РМЖ с учетом экспрессии молекулярных маркеров

Экспрессия молекулярных маркеров Общая группа (п=141) ТАС (п= 82) ТС (п= 59)

п % 95% ДИ п % 95% ДИ п % 95% ДИ Р

Экспрессия бета-тубулин П1 класса (п=140)

высокая 61 43,6 35,4-51,9 36 44,4 33,7-55,5 25 42,4 29,9-55,4 0,81

низкая 79 56,4 48,1-64,6 45 55,6 44,5-66,3 34 57,6 44,6-70,1

Экспрессия топоизомераза II альфа (п=137

высокая 73 53,3 44,8-61,6 44 55,7 44,5-66,6 29 50,0 37,0-63,0 0,51

низкая 64 46,7 38,4-55,2 35 44,3 33,4-55,5 29 50,0 37,0-63,0

Детекция мутации гена BRCA1 (п=141)

BRCA1 обнаружена 9 6,4 2,9-11,0 4 4,9 1,3-10,7 5 8,5 2,7-17,1 0,39

Трепан-биопсия опухоли молочной железы выполнялась на этапе скри-

нинга. По завершению предоперационной химиотерапии проводилось исследование операционного материала. Отмечалось расположение опухолевого узла в ткани молочной железы, ее размеры, гистологический тип инвазивного рака, наличие дуктального или долькового рака in situ, инвазия в кожу или мышцу, ширины краёв резекции, поражение лимфатических узлов, лечебный патомор-фологический ответ на проведенное предоперационное лечение [Miller, Payne 2002]. При этом под резидуальной (остаточной) опухолью понимали 1, 2, 3, 4 степени патоморфологического ответа опухоли, где 4 степень считалась частичным патоморфологическим ответом. Под 5 степенью (урТО) понимали отсутствие опухолевых клеток в секционных срезах из места расположения первичной опухоли (допустимо наличие протоковой карциномы in situ). Отдельно исследовались регионарные лимфоузлы. В случае отсутствия в них метастазов,

давалась оценка pCR — ypTONO. Подсчет митотической активности на гистологических срезах опухоли рака проводился в 10 полях зрения [Омельчук H.H., Волкова Л.В., 2014].

На основании иммуногистохимической оценки выделялись следующие биологические подтипы: люминальный А; люминальный В (HER2- -негативный); люминальный В (НЕЯ2-позитивный); трижды негативный; HER2 — позитивный (табл. 3).

Таблица 3 — Биологические иммуногистохимические подтипы РМЖ

Подтип Основная характеристика по данным ИГХ- исследования

Люминальный А Положительные рецепторы эстрогенов (ER) и рецепторы прогестерона (PR) (по Allred); гиперэкспрессия HER2 отсутствует; низкая (G1) и умеренная (G2) степень злокачественности по Ellis-Elston или Ki 67 20% или люминальный В (HER2 +): положительные ER и PR; гиперэкспрессия HER2.

Трижды негативный ER-/ PR -/ HER2-

HER2 — позитивный Гиперэкспрессия HER2 и отсутствие определяемых гормональных рецепторов (ER-/PR-)

Молекулярно-генетическое тестирование на экспрессию генов топоизо-

меразы II альфа и бета-тубулинов III класса выполнялось методом полуколичественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реальном времени с использованием TaqMan-проб на приборе BioRad CFX96 Real-time PCR Detection System [Imyanitov E.N., 2006]. Показатели экспрессии ниже 20 процентиля относились к категории «низкой» экспрессии, а выше 80 процентиля — к категории «высокой» (рис. 1).

2 Ъ-íubulm III / VSOHA Ш11—1.6 ; I SDHÄ ¿-tubulin Ml асв5.з 1 j

D из я за « IQ то за ‘0 Cid«

Рис. 1 — Примеры образцов с высокой (А) и низкой (В) экспрессией бета-тубулинов III класса.

Оценка эффективности проводимого лекарственного лечения выполнялась каждые 2 цикла с помощью физикального метода (пальпации), маммографии, ультразвукового исследования с соноэластографией и маммосцинтигра-фии. В случае стабилизации процесса после первых 2-х циклов химиотерапии был предусмотрен переход в другую лечебную группу.

Ультразвуковое исследование проводилось с использованием линейного датчика частотой 13 МГц с опцией T-Elasto.

Маммография проводилась в краниокаудальной и медиолатеральной плоскостях, а при необходимости снимки выполнялись и в латеромедиальных косых плоскостях. Характеристики опухолей молочной железы описывались согласно рекомендациям системы BI-RADS.

Маммосцинтиграфия осуществлялась на эмиссионном компьютерном томографе с двумя прямоугольными детекторами, снабженными низкоэнергетическими, высокочувствительными коллиматорами.

Статистическая обработка материала

Результаты динамического наблюдения за пациентами, получившими предоперационную химиотерапию, были введены в созданную в пакете Microsoft Office Excel базу данных и анализировались с применением пакета прикладных программ для статистического анализа STATISTICA v. 10 и встроенных функций пакета Microsoft Office Excel. Большинство изучаемых показателей являлось качественными, измеренными по номинальной или порядковой шкалам. Для таких переменных проводилась точечная и интервальная оценка распределения частот, при этом в качестве интервальной оценки строился 95% доверительный интервал, который вычислялся с помощью углового преобразования Фишера. В качестве статистического критерия для проверки гипотезы о значимости различий частот в независимых группах использовался критерий у\ При анализе многопольных таблиц его применение считалось корректным, если в таблице ожидаемых частот доля ячеек с частотами, меньшими 5, не превышала 25%, в противном случае проводились попарные сравнения частот критери-

ем (при необходимости — с поправкой Йетса), или с помощью точного критерия Фишера.

Количественные переменные, измеренные по непрерывной шкале, представлены в виде среднего арифметического (М) и стандартного отклонения (а) — при отсутствии значимых отличий от нормального закона (критерий Шапиро— Уилка); медианой, нижним (Q1) и верхним (Q3) квартилями — в противном случае; соответственно, статистические сравнения выполнялись с помощью критерия Стьюдента или Манна-Уитни.

Для анализа выживаемости больных использовался метод Каплана-Мейера, при этом сравнение выживаемости в группах пациентов осуществлялось лог-ранговым критерием.

Как и в большинстве исследований, касающихся оценке эффективности неоадъювантного системного лечения, в работе представлены результаты анализа бессобытийной выживаемости (event free survival) [EFS], К событиям относятся: местный и регионарный рецидив, отдалённые метастазы, возникновение метахронного рака противоположной железы, возникновение первичных опухолей другой локализации, смерть от РМЖ или от любых причин.

При проведении статистического анализа критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы принимался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объективный клинический ответ опухоли на проведение 2-х циклов химиотерапии показал значимое преимущество схемы TAC перед схемой ТС. Полный патоморфологический ответ (ypTONO) в ткани молочной железы и регионарных метастазах не выявил достоверных различий между таксан-содержащей химиотерапией с антрациклинами и без антрациклиновых антибиотиков, так как в случае стабилизации после 2-х циклов полихимиотерапии по схеме ТС (стабилизация расценивается в неоадъювантном режиме как недостаточный ответ) больные переводились в группу TAC (рис. 2).

10 20 30 40 50 60 70 80 90

Объективный клинический ответ : 82,9

4+5 ст. патоморфологического ответа в опухоли рСЯ в опухоли и л/узлах 29,3 «TAC ¡::|»:|g|S| 22,0 «ТС 13,6

Рисунок 2 — Частота объективного клинического ответа и патоморфологического регресса (ypTONO) опухоли после неоадъювантной химиотерапии (TAC против ТС) у больных местно-распространенным РМЖ.

В исследовании отмечено 4-кратное увеличение частоты pCR в группе больных с трижды негативным подтипом опухоли по сравнению с люминаль-ным В подтипом. Частота pCR при сравнении всех подтипов равнялась 8,5%, 6,7%, 23,8% и 25,8%, соответственно (рис. 3).

Ш Люминальный А Ч Люминальный В * HER2+

Специфичность 50,4 [41,2-59,6] 53,4 [44,0-62,6] 74,6 [65,7-82,1] pi, з=0,0001 р2^з= 0,0007 р,.2=0,64

Диагностическая точность 56,43 [47,8-64,8] 59,1 [50,4-67,4] 76,6 [68,7-83,4] pi,з=0,0004 Р2,з=0,0019 Pi.2-0.65

Предсказательная ценность положительного результата 23,1 [14,3-34,0] 24,7 [15,3-36,1] 36,2 [22,7-51,5] Pi,з=0,11 Р2,з= 0,18 PI.2=0,82

Предсказательная ценность отрицательного результата 98,4 [91,3-99,7] 98,4 [91,6-99,7] 97,8 [92,2-99,7] Pi,3=0,79 Р2,3=0,77 Pi.2=0,98

Таблица 5 — Чувствительность, специфичность, диагностическая точность, предсказательная ценность положительного и отрицательного результата маркеров бета-тубулинов III класса и топоизомеразы II альфа в выявлении клинически значимого патоморфологического ответа (4+5 степени)

Диагностические показатели низкая экспрессия TUBIIIB %, 95%ДИ высокая экспрессия TOPIIA %, 95%ДИ 4- TUBIIIB Т TOPIIA, %, 95%ДИ Р

Чувствительность 86,1 [70,5-95,3] 94,3 [80,8-99,1] 82,9 [66,3-93,4] Р1.з=0,70 Р2,3= 0,13 Р 1.2=0,25

источник

ЭКСПРЕССИЯ ТОПОИЗОМЕРАЗЫ-2Α И Е-КАДГЕРИНА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РЕПРОДУКТИВНОМ СТАТУСЕ БОЛЬНЫХ

1 УДК ЭКСПРЕССИЯ ТОПОИЗОМЕРАЗЫ-2Α И Е-КАДГЕРИНА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РЕПРОДУКТИВНОМ СТАТУСЕ БОЛЬНЫХ Шатова Ю.С.¹, Ващенко Л.Н.¹, Новикова И.А.¹, Златник Е.Ю.¹, Владимирова Л.Ю.¹, Ульянова Е.П.¹, Комова Е.А.¹, Черникова Е.Н.¹, Машурова С.А. 2 1 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на- Дону, Россия (344037, Ростов-на-Дону, ул. 14 линия, 63) 2 ГАУ РО «ОКДЦ» Ростов-на-Дону, Россия (344010, Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 127) Выявление иммуногистохимических маркеров опухолевых клеток позволяет уточнить характеристики различных подтипов РМЖ и индивидуализировать тактику лечения больных. Иммуногистохимическим методом изучена экспрессия маркеров топоизомеразы-2α и Е-кадгерина в клетках РМЖ у 95 пациенток с различными биологическими подтипами и состоянием овариально-менструальной функции. В клетках Her2neu+ опухолей экспрессия топоизомеразы 2α была выше, чем при других подтипах, а экспрессия Е- кадгерина в опухолях различных подтипов не различалась. В опухолях женщин, находящихся в постменопаузе, наблюдался высокий уровень экспрессии обоих маркеров. У больных в перименопаузе отмечен низкий уровень экспрессии топоизомеразы-2α и высокий Е-кадгерина, а при сохранной овариально-менструальной функции выявлена умеренная экспрессия топоизомеразы-2α и наиболее низкая Е-кадгерина. Итак, показаны особенности экспрессии топоизомеразы-2α и Е-кадгерина при различных биологических подтипах РМЖ и репродуктивном статусе больных. Ключевые слова: рак молочной железы, топоизомераза-2-альфа, Е-кадгерин ТOPOISOMERASE-2Α AND Е-CADHERIN EXPRESSION IN DIFFERENT BREAST CANCER SUBTYPES AND REPRODUCTIVE STATUSES OF PATIENTS Shatova J.S.¹, Vashhenko L.N.¹, Novikova I.A.¹, Zlatnik E.J.¹, Vladimirova L.J.¹, Uljanova E.P.¹, Komova E.A.¹, Chernikova E.N.¹, Mashurova S.A. 2 ¹Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russia (63, 14 Liniya Str., , Rostov-on-Don), 2 Regional Consultive Diagnostic Center, Rostov-on-Don, Russia (127, Pushkinskaya Str., , Rostov-on-Don) Detection of new immunohistochemical markers allows specifying the different breast cancer subtypes and personalization of the treatment. Topoisomerase 2α and E-cadherin expression were determined by immunohistochemical methods in tumors of 95 patients with different breast cancer subtypes and ovarian function. The maximal levels of topoisomerase 2α positive cells were found in Her2neu+ subtype in comparison with triple negative, luminal A and luminal B subtypes while E-cadherin expression was similar in all the subtypes. In postmenopausal patients both markers were highly expressed. In perimenopausal patients topoisomerase 2α demonstrated low expression and E-cadherin the high one. In tumors of patients with normal ovarian function E-cadherin expression was shown to be the lowest of all the groups and topoisomerase 2α expression was moderate. Thus some peculiarities of topoisomerase 2α and E-cadherin expression in patients with various breast cancer subtypes and reproductive statuses were shown. Keywords: breast cancer, topoisomerase 2α, E-cadherin Как свидетельствуют исследования последних лет, рак молочной железы (РМЖ) является гетерогенным заболеванием [4]. Выявление новых иммунногистохимических маркеров и оценка их прогностического значения позволяют уточнить характеристики различных подтипов РМЖ [2] и индивидуализировать тактику лечения больных [4]. Топоизомераза-2-альфа (Topo2α) и Е-кадгерин участвуют в таких важных процессах, как регуляция клеточного цикла, сигнальной трансдукции, адгезия, дифференцировка и миграция опухолевых клеток. Данные литературы о зависимости частоты и уровня

2 экспрессии этих маркеров от биологического подтипа РМЖ противоречивы. Так, по данным одних авторов, частота гиперэкспрессии Topo2α составляет 36 61,4% и повышается при р53+ и высокой степени злокачественности вне зависимости от биологического подтипа РМЖ; другие авторы сообщают о выявлении Topo2α+ у 93,1% Her2neu+ больных [5]. В исследовании, выполненном на группе больных с Her2neu+ метастатическим РМЖ, помимо связи Topo2α+ и Her2neu+, показана ассоциация Topo2α+ с PIK3CA и положительными рецепторами эстрогенов, а добавление в план лечения, помимо Трастузумаба, антрациклинов улучшает результаты лечения у Topo2α+ больных [6]. Значимость Е-кадгерина показана при изучении различных злокачественных опухолей и связана с его свойствами супрессора опухолевого роста и инвазивности (желудка, легкого, шейки матки, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря) [1]. Однако в исследовании на материале 98 больных РМЖ показано, что прогностическая значимость этого маркера сомнительна. Тем не менее выявлена его корреляция со степенью дифференцировки опухоли и отсутствием метастазов в регионарных лимфоузлах [8]. Экспрессия Е-кадгерина описана как фактор положительного прогноза выживаемости больных РМЖ, особенно при тройном негативном раке (ТНР) [7], хотя именно он характеризуется неблагоприятным течением. Установлено значительное подавление экспрессии Е-кадгерина у больных с мультицентрическим ростом РМЖ в сравнении с уницентрическим [10], причем, по мнению авторов, с этим связан его негативный прогноз. Проведение корреляционного анализа экспрессии Е-кадгерина и рецепторов андрогенов показало, что при ТНР с увеличением уровня экспрессии рецепторов андрогенов (РА) экспрессия Е-кадгерина снижается, а профиль опухоли РА+/Е-кадгерин говорит о повышенном риске рецидивирования и метастазирования [9]. Таким образом, литературные данные о значимости Е-кадгерина и Topo2α+ при различных биологических подтипах РМЖ разрознены и противоречивы; кроме того, остается неисследованной экспрессия этих маркеров у больных РМЖ при их различном репродуктивном статусе, что может играть роль в течении заболевания и ответа опухоли на терапию с учетом связи обоих маркеров с экспрессией рецепторов к гормонам. Цель исследования: изучить экспрессию маркеров Topo2α+ и Е-кадгерина при различных биологических подтипах РМЖ и при различном репродуктивном статусе больных. Материалы и методы Была изучена экспрессия маркеров Topo2α и Е-кадгерина в клетках РМЖ 95 пациенток с различными молекулярно-биологическими подтипами с помощью иммуногистохимического (ИГХ) анализа, который проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, удаленных при операции и предназначенных для стандартного

3 морфологического исследования. Использованные в работе первичные антитела и их разведения представлены в таблице 1. Таблица 1 Панель использованных для ИГХ-анализа антител Специфичность Клон Фирма Разведение Буфер для «демаскировки антигенов» Topo2α SWT 3D1 DCS 1:25 10 ммtris, 1 ммedta (рн 6,0) Е-кадгерин NCH-38 DAKO 1: ммtris, 1 ммedta (рн 6,0) Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 65 0 С, восстановление антигена в течение 20 мин при температуре 97 0 С и дальнейшее охлаждение до 65 0 С. Затем стекла промывались в течение 1 3 мин TBS-буфером (Dako) и помещались в автостейнер ThermoScientific для окрашивания в автоматическом режиме. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB DetectionSystem. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40. Для рецепторов Topo2α оценивали количество опухолевых клеток, положительных по ядерной экспрессии данного маркера, и подсчитывали количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения. Для Е-кадгерина оценивали количество клеток, положительных по мембранной экспрессии данного маркера, учитывали выраженность реакции: 0 отсутствие реакции, 1 слабая реакция, 2 умеренная реакция, 3 сильная реакция; кроме того, обращали внимание на полное или неполное мембранное окрашивание, а также наличие цитоплазматического окрашивания. Статистическую обработку результатов проводили параметрическими и непараметрическими методами (t-критерий Стьюдента, критерий Уилкоксона). Результаты и обсуждение Из 95 пациенток у 26 (27,4%) был определен люминальный А подтип, у 33 (34,7%) люминальный В подтип, у 15 Her2neu+ (15,8%), у 21 ТНР (22,1%). 31 больная имела сохранную овариально-менструальную функцию, 45 находились в постменопаузе, 19 в перименопаузе. Окрашивание ядер опухолевых клеток антителами к Topo2α отмечено при всех исследованных подтипах РМЖ. Как видно из таблицы 2, содержание положительно окрашенных клеток было максимальным при Her2+ подтипе, при TНР и при люминальном В подтипах РМЖ оно было статистически значимо ниже, а при люминальном А подтипе

источник

Гистологическую градацию рака молочной железы (РМЖ) впервые ввел R.B. Greenough из Бостона, который в 1925 г. опубликовал анализ 73 случаев РМЖ.

Несмотря на то что прошло много времени и опубликовано большое количество работ о применении гистологической градации рака молочной железы, ничего существенного не добавлено в перечень морфологических критериев, которые определяют группы РМЖ, имеющие клиническое значение.

Работа R.B. Greenough актуальна и сегодня, он сформулировал прогностически значимые категории инвазивного рака молочной железы низкой, средней и высокой степени злокачественности.

Это деление базируется на 5 признаках:

1) тканевой (гистологической) организации опухоли, то есть способности образовывать дольки, протоки и железистоподобные структуры;
2) степени секреторной активности, которая подтверждается цитоплазматическими вакуолями, капельками муцина в просвете желез;
3) клеточной атипии, то есть единообразии или вариации размеров и формы клеток, соотношении размеров ядра и цитоплазмы;
4) наличии гиперхромных ядер;
5) наличии ядерной атипии и количества митотических фигур.

В соответствии с градациями по Greenough типы рака высокой степени злокачественности имеют клетки и ядра неправильной формы и различного размера, без секреторной функции, клетки расположены столбцами, отмечают гиперхроматоз ядер и большое количество атипичных митозов.

И наоборот, опухоли, состоящие из желез, построенных из единообразных по размеру и строению клеток без гиперхроматоза, с малым количеством митозов, следует относить к РМЖ низкой степени злокачественности.

По данным R.B. Greenough, после радикальной мастэктомии пациентки с раком низкой степени злокачественности были излечены в 68%, умеренной — в 33% случаев и нулевым был результат при высокой.

В 1928 г. Patey и Scarff из Лондона опубликовали анализ 50 случаев рака молочной железы. Они изучили корреляцию между гистологической градацией по Greenough, статусом лимфатических узлов и выживаемостью пациенток. Выявлено, что пациентки с раком низкой степени злокачественности после радикальной мастэктомии излечивались в 85%, средней степени — в 45% и высокой — в 23% случаев.

Кроме того, авторы отметили, что прогноз течения заболевания всегда хороший при отсутствии метастазов в лимфатических узлах, изъязвления опухоли и распространения ее на фасции независимо от гистологической степени злокачественности по Greenough.

Они также сделали заключение, что в случаях нераспространенного РМЖ более продолжительный период ремиссии, то есть период до появления метастазов или рецидивов после радикальной мастэктомии, у пациенток с опухолью низкой степени злокачественности по Greenough, а в случаях распространенного рака — более эффективна паллиативная терапия.

Последующая работа H.J.C. Bloom из Лондона, опубликованная в 1950 г., подтвердила выводы Patey и Scarff. В классическом труде Bloom-Richardson, опубликованном в 1957 г., окончательно сформулированы критерии гистологической градации РМЖ. В своей работе они проанализировали течение болезни 1409 пациенток, из которых 359 прожили более 15 лет.

Подобно R.B. Greenough, исследователи разделили рак молочной железы (РМЖ) на 3 категории, базируясь на трех показателях:

1) относительном количестве тубулярных структур;
2) наличии вариаций размеров клеток рака;
3) количестве гиперхромных ядер и фигур митоза.

Каждый из этих показателей авторы оценили в баллах (1, 2 или 3 балла). Суммируя количество баллов, получим возможные комбинации от 3 до 9. Наименьшее количество баллов соответствует наиболее низкой степени злокачественности рака молочной железы.

Авторы разделили шкалу злокачественности на три части: 3, 4 или 5 суммарных баллов — низкая степень злокачественности (grade 1); 6 или 7 суммарных баллов — средняя (grade 2); 8 или 9 — высокая (grade 3). Эта схема стала наиболее популярной в мире и называется схема градации РМЖ по Bloom-Richardson или технология Scarff-Bloom-Richardson, хотя должна была называться техникой градации по Greenough, в честь человека, впервые опубликовавшего эту градацию в 1925 г.

Bloom и Richardson установили, что 26% из 1409 исследованных случаев РМЖ имели 1-ю степень гистологической злокачественности, 45% — 2-ю, 29% — 3-ю. Результаты сравнения гистологических степеней злокачественности первичной опухоли и метастазов в аксиллярных лимфатических узлах показали, что в 82% степени совпадали.

В 12% случаев степень злокачественности была выше, а в 6% — ниже в метастазе, чем в первичной опухоли. Авторы выявили, что степень гистологической злокачественности, как и статус регионарных лимфатических узлов, дает независимую прогностическую информацию (табл. 2).

Таблица 2. Выживаемость пациенток с РМЖ в соответствии с градационной схемой Bloom-Richardson (исследованы 1409 пациенток).

Bloom и Richardson пришли к выводу, что степень гистологической злокачественности рака молочной железы отражает предполагаемое клиническое течение заболевания и вероятность развития метастазов в дальнейшем, что стало в свое время очень прогрессивным учением.

Очевидно, что степень гистологической дифференцировки имеет корреляцию с темпами роста опухоли и соответственно показателями S-фазы митотического цикла (ЗН-тимидина, Ki67), показателями анеуплоидии, экспрессией С-егВ-2, рецепторов эстрогена и прогестерона.

Важность этого показателя очевидна, однако в ряде публикаций гистологическое стадирование подвергается жесткой критике из-за трудности, возникающей при его воспроизводимости. Отмечают, что процент расхождения в оценке гистологической дифференцировки иногда составляет 50-60%.

Однако когда критерии оценки гистологической степени злокачественности оценивают профессионально и тщательно, совпадение результатов этой оценки составляет 90%.

H.F. Frierson и соавторы прорецензировали патологоанатомические заключения 7 патологоанатомов, проводивших исследование 75 случаев инвазивного протокового РМЖ. Совпадение при оценке гистологической структуры составило 71%, тубулярных структур — 81%, полиморфизма ядер — 64%, митозов — 67%.

C.W. Elston рекомендует проводить двойное исслeдoвание. Это возможно при проведении исследования двумя патологами или одним патологом дважды на разных образцах.

Следующим недостатком предложенной Bloom и Richardson системы градаций РМЖ стало то, что большая часть пациентов относится к 2-й и 3-й степени градации. С .W. Elston, используя модифицированную систему гистологической градации Bloom и Richardson, исследовал рак молочной железы у 1831 пациентки с периодом наблюдения 16 лет и диагностировал 1-ю степень гистологической дифференцировки рака в 18%, 2-ю — в 34%, 3-ю — в 47% случаев.

Автором отмечена очень выраженная корреляция с клиническим прогнозом. У пациенток с раком 1-й степени злокачественности значительно лучшая выживаемость, чем со 2-й и 3-й степенью (р

План лечения составляют с учётом стадии опухолевого процесса, морфологической структуры опухоли, возраста больной, сопутствующих заболеваний, общего состояния пациентки. Применяют следующие методы лечения: хирургический, комбинированный (сочетание операции с лучевой или лекарственной терапией) и ком.

По данным многочисленных публикаций, этиология и патогенез РМЖ сложны и определяются сочетанием многих факторов. Гормональная регуляция функции молочных желез значительно сложнее, чем эндометрия. Помимо эстрогенов и прогесторона, развитие молочных желез в пубертатном периоде, их функция во время бер.

источник

Рак молочной железы, как известно, является гетерогенным заболеванием. Это означает, что одно и то же проявление болезни может быть обусловлено мутациями в разных генах или разными мутациями внутри одного гена. Существует много подвидов заболевания, которые могут быть определены с помощью генетического тестирования или на основе методов с использованием иммуногистохимических анализов.

В мультигенных тестах пролиферация (разрастание клеток) оказывает существенное влияние на прогнозирование риска рецидива заболевания. В дополнение к определению обычных гистологических параметров оценка пролиферации является одним из важнейших факторов для принятия решения о лечении у больных раком молочной железы.

Широкий диапазон методов доступен для оценки разрастания опухолевых клеток, в частности, вычисление митотических фигур в сегментах окрашенных тканей, анализ проточной цитометрии для определения доли клеток, находящихся в фазе роста клеточного цикла, рассмотрение индекса тимидин-маркирования пролиферирующих клеток ядерных антигенов.

Ki-67 представляет собой ядерный белок, связанный с клеточной пролиферацией. Первоначально он был идентифицирован в начале 1980-х годов при исследовании мышиного моноклонального антитела, направленного против ядерного антигена лимфомы Ходжкина. Наиболее распространенным методом анализа антигена Ki-67 является иммуногистохимическая оценки.

Было выявлено, что ядерный антиген Ki-67 экспрессируется в определенных фазах клеточного цикла. Экспрессия генов — это процесс преобразования информации от гена в конечный продукт — РНК или белок. С помощью иммунологического окрашивания с моноклональными антителами Ki-67 можно оценить долю роста популяции опухолевых клеток и выявить прогноз течения болезни.

Ki-67 является раковым антигеном, который обнаруживается в растущих, разделяющихся клетках, но отсутствует в фазе покоя клеточного роста. Эта характеристика делает Ki-67 хорошим маркером опухоли. Анализ проводится на образце ткани опухоли, чтобы помочь предсказать прогноз роста опухоли.

Тест Ki-67 не рекомендован как обязательный при проведении гистологического исследования опухоли молочной железы. Но при агрессивных формах рака врач может назначить этот тест, чтобы увидеть влияние Ki-67 на рост опухоли. Анализ делается в комплексе с другими исследованиями. На основании общих результатов всех полученных анализов вырабатывается план лечения.

Положительный анализ Ki-67 дает более высокий риск рецидива и худший уровень выживаемости у пациентов с ранними стадиями рака молочной железы. В повседневной клинической работе Ki-67 широко используется в качестве дополнительного фактора для принятия решений по адъювантной (дополняющей хирургическую и лучевую) стратегии лечения.

Опухоль молочной железы с высокими баллами Ki-67 состоит из клеток, которые быстро делятся и растут. Химиотерапевтические препараты высоко эффективны как раз для клеток-мишеней, которые растут за пределами нормальной скорости. Поэтому опухоли с более высоким уровнем Kи-67 хорошо реагируют на химиотерапию. Информация об уровне Ki-67 поможет врачу более точно определить, какое лечение будет работать лучше в данном конкретном случае.

Подготовка к анализу Ki-67 не требует каких-либо специальных условий проведения. Используются стандартные методы подготовки материала для гистологического исследования тканей молочной железы.

Анализ проводят путем окрашивания, что позволяет измерить процент опухолевых клеток, которые являются положительными для Ki-67. Чем больше положительных клеток, тем быстрее они делятся и образуют новые клетки.

При проведении анализа применяют следующие методы:

• проводится иммуногистохимическое окрашивание злокачественных клеток ядерного антигена Ki-67. Результат оценивается количественным и визуальным способом с помощью световых микроскопов;
• значение онкомаркера считается как процент положительно маркированных злокачественных клеток с использованием анти-человеческого Ki-67 моноклонального антитела MIB1, которое является одним из наиболее часто используемых антител и рассматривается как «золотой стандарт»;
• процентная оценка Ki-67 определяется как процент положительно окрашенных клеток опухоли среди общего количества злокачественных клеток. Результат не зависит от интенсивности окраски;
• точка отсечки Ki-67 на 15% была определена в соответствии с опытом различных патологоанатомов, а также общепринятых национальных и международных медицинских рекомендаций;
• подсчет результата проводится с учетом раздела всей опухоли.

При раке молочной железы результат Ki-67 менее 10% считается низким, 10-20% пограничным и 20% – высоким.

В таблице 1 показаны средние значения Ki-67 в зависимости от стадии заболевания, размера опухоли и других параметров.

Таблица 1 – Средние показатели Ki-67 в зависимости от различных показателей заболевания

Отсутствие положительной динамики индекса онкомаркера в процессе проводимого лечения говорит о неблагоприятном течении и прогнозе болезни.

Ki67 служит индикатором прогноза остаточного риска у больных раком груди, получавших эндокринную терапию Летрозолом или Тамоксифеном. Использование эндокринной терапии напрямую коррелирует с уровнем Ki-67. Показатель онкомаркера после приема медикаментов рассматривается в качестве индекса резидуального (остаточного) заболевания после проведения лечения.

Динамика изменения индекса в ходе проведения химиотерапии помогает принять решение о ее целесообразности в конкретном случае. Снижение уровня Ki-67 происходит в любом случае проведения неоадъювантной химиотерапии. Отсутствие падения уровня онокомаркера является предвестником неблагоприятного прогноза заболевания.

источник

Биологические (тканевые, клеточные, молекулярные) маркеры определяются непо­средственно в опухолевой ткани и характеризуют индивидуальные особенности опухоли, специ­фику ее «поведения» и регуляции. Количество показателей, рассматривающихся в качестве по­тенциальных биомаркеров, увеличивается лави­нообразно, что отражает быстрый прогресс в об­ласти изучения механизмов регуляции пролифе­рации и дифференцировки опухолевых клеток.

При раке молочной железы (РМЖ) определение любого молекулярного маркера в принципе мо­жет преследовать две практические задачи:

1. вы­явление группы риска, требующей дополнитель­ного лечения или более тщательного наблюде­ния, среди больных с ранними стадиями, не под­лежащих адъювантной терапии по клиническим и другим лабораторным показаниям;
2. оценка чувствительности к определенным видам тера­пии и(или) индивидуализация схем адъювантного лечения больных с распространенным процес­сом.

Еще одним аспектом практического исполь­зования результатов изучения молекулярно-биологических характеристик РМЖ может быть раз­работка новых препаратов, направленно воздей­ствующих на исследуемые белки (или гены) и блокирующих регулируемые ими процессы.В связи с тем, что, как уже отмечалось, ко­личество потенциально значимых биомаркеров очень велико, необходимы четкие критерии, по­зволяющие рекомендовать каждый конкретный показатель для практического применения. Основные условия включения маркера в схему обследования больного и использования резуль­татов его определения для выбора лечения сле­дующие:

1. его включение должно приводить к более благоприятным результатам лечения — увеличению безрецидивной или общей выжива­емости, улучшению качества жизни и(или) сни­жению стоимости;
2. эти преимущества должны иметь I уровень доказательности (АSСО) — до­казательства получены либо в специальном мас­штабном рандомизированном проспективном исследовании, либо в результате мета-анализа значительного числа относительно небольших исследований;
3. необходимы стандартизован­ные воспроизводимые методы с четко обозна­ченными критериями, а также наличие внутренних и внешних программ контроля качества.

В связи с этим количество биомаркеров, реально используемых и рекомендуемых международны­ми организациями для обследования больных РМЖ, весьма ограничено.

Рецепторы стероидных, гормонов — крите­рий чувствительности к эндокринной терапии

Одним из первых вошедших в практику лечения больных РМЖ показателей, относящихся к ка­тегории биологических маркеров, были рецеп­торы стероидных гормонов — белки, специфи­чески и избирательно связывающие соответст­вующие стероиды после их проникновения в клетку и опосредующие, таким образом, их био­логические эффекты. Сначала обратили внима­ние на рецепторы эстрогенов (РЭ), несколько позднее стали определять также рецепторы про­гестерона (РП). Присутствие РЭ в первичной опухоли молочной железы свидетельствует о ее потенциальной чувствительности к лечебным мероприятиям, направленным на удаление ис­точника эстрогенов из организма или на проти­водействие их эффектам. РП представляет инте­рес как молекулярный маркер РМЖ не только потому, что он является первым необходимым звеном реакции клетки на прогестины и опреде­ляет ее чувствительность к соответствующим препаратам, но и потому, что его синтез в клет­ках РМЖ индуцируется эстрогенами.

Таким об­разом, наличие РП может свидетельствовать о том, что РЭ, по крайней мере частично, функци­онально активны. Адъювантная эндокринная терапия наиболее эффективна у больных РМЖ с положительным рецепторным статусом: ее эф­фективность составляет около 10% при РЭ-отрицательных опухолях, примерно 50% — при РЭ-положительных опухолях и около 75% — при опухолях, содержащих одновременно РЭ и РП.

Известно также, что опухоли молочной же­лезы, содержащие оба или хотя бы один из ре­цепторов стероидных гормонов, имеют более благоприятное течение и послеоперационный прогноз у больных с такими опухолями, незави­симо от проводимого адъювантного лечения, лучше, чем у больных с рецепторотрицательными опухолями. Однако различия в выживаемо­сти не очень велики, поэтому наиболее важной в практическом отношении областью использова ния результатов определения РЭ и РП является отбор больных, чувствительных к эндокринной терапии. Практическое значение определения РЭ и РП для назначения эндокринной терапии подтверждено мета-анализом,-включавшим 37 тыс. больных операбельным РМЖ, участвовав­ших в 55 рандомизированных исследованиях.

В настоящее время в различных клиниках и лабораториях используется 3 относительно рав­нозначных метода определения рецепторного статуса РМЖ:

• радиолигандный — оценка связы­вающей способности рецепторов в цитозолях опухолей,
• иммуноферментный — определение концентрации иммунореактивного рецепторно­го белка в тех же цитозолях
• иммуногистохимический — специфическое окрашивание срезов опухоли с помощью антител к рецепторным бел­кам.

Преимуществом первых 2 методов является их количественный характер, позволяющий объ­ективизировать критерии оценки рецепторного статуса. Радиолигандный метод позволяет также оценить и функциональную активность рецепто­ра на одной из первых стадий его взаимодействия с гормоном, что делает прогноз гормоночувстви-тельности более надежным, чем при определе­нии иммунореактивных белков. С другой стороны, иммуногистохимический метод, хотя и носит относительно субъективный полуколи­чественный характер, имеет важное достоинство, заключающееся в том, что при окрашивании сре­зов можно четко определить принадлежность рецепторов именно опухолевым клеткам, что практически невозможно при использовании биохимических методов. Кроме того, этот метод позволяет работать с архивным материалом — парафиновыми блоками и даже готовыми стек­лами, что делает его единственно возможным вариантом в случаях, когда необходимость ис­следования рецепторов стероидных гормонов возникла или была осознана спустя длительное время после операции. Совпадение результатов определения рецепторного статуса РМЖ всеми 3 методами составляет в среднем 80—85%.

Факторы роста и их рецепторы — показа­тель способности опухоли к саморегулируемому ро­сту

Поскольку резистентность к эндокринной терапии может наблюдаться с самого начала даже у РЭ- и РП-положительных опухолей или разви­ваться позднее по мере прогрессирования болез­ни, рецепторный статус оказался необходимым, но не всегда достаточным показателем гормоно-чувствительности РМЖ. В связи с этим постоянно ведется поиск дополнительных критериев, хара­ктеризующих их функциональную активность и влияние других регуляторных факторов на био­логическое поведение РМЖ.

К числу важнейших регуляторов подобного типа относятся полипептидные факторы, продуцируемые опухолевыми клетками и другими компонентами опухолевой ткани (фибробластами, инфильтрирующими опухоль макрофагами и лимфоцитами, эндоте-лиоцитами) и стимулирующие рост клеток-про­дуцентов (аутокринный механизм) или соседних клеток (паракринный механизм). Многими исследователями, в том числе и в нашей лаборатории, было показано, что на­личие в опухоли молочной железы рецепторов эпидермального фактора роста (РЭФР), особен­но при отсутствии рецепторов стероидных гор­монов, свидетельствует о неблагоприятном про­гнозе заболевания даже на ранних стадиях и о резистентности к эндокринной терапии. Тем не менее из-за неоднозначности результа­тов, полученных разными авторами, ни один из показателей, характеризующих чувствитель­ность РМЖ к ауто/паракринным регуляторам, не вошел пока в рутинную клиническую практи­ку. Можно ожидать, однако, что в ближайшее время интерес к исследованию РЭФР при РМЖ вновь возрастет в связи с тем, что на стадию кли­нических испытаний вышли препараты, специ­фически воздействующие на РЭФР, — моно-клональные антитела к рецептору (цетуксимаб) и ингибиторы внутренней тирозинкиназы РЭФР, реализующей первый этап передачи митогенного сигнала (например, пресса).

Следует отметить, что до последнего време­ни «золотым стандартом» при исследовании РЭФР считалось радиолигандное определение в мембранной фракции тканей с использовани­ем 1251, меченного ЭФР, и разделением на гидроксилапатите, однако все большее значение приобретает и иммуногистохимический метод, прежде всего вследствие его удобства и большей безопасности.

НЕR2/neu — мишень для специфической тера­пии

Определенный прорыв в области практиче­ского использования маркеров, связанных с РЭФР-зависимой регуляцией роста РМЖ, про­изошел после появления герцептина, представля­ющего собой гуманизированные антитела к НЕR2/neu — одному из тирозинкиназных ре­цепторов семейства еrbB, к которому принадле­жит и РЭФР. Это одна из важнейших систем передачи митогенного сигнала в клетке.

Помимо структуры, рецепторы семейства еrbB различают­ся по относительной специфичности и сродству к различным общим лигандам (активирующим факторам). Основной особенностью всех рецеп-торных тирозинкиназ являются трансмембран­ная локализация и необходимость во взаимодей­ствии с соответствующим лигандом для реализа­ции киназной активности и последующих биоло­гических эффектов. После активации в результа те связывания лигандов и димеризации внутрен­няя тирозинкиназа рецепторов активируется и приобретает способность фосфорилировать как сам рецептор, так и другие клеточные белки. Ре­цепторы семейства ЕrbB могут образовывать как гомо-, так и гетеродимеры, при этом во многих случаях наиболее активными являются гетерост-руктуры с участием рецептора НЕR2/neu — уни­кального представителя рассматриваемого семейства, который, не имея собственного лиган-да и не взаимодействуя ни с одним из известных факторов роста, активирующих родственные рецепторы, является тем не менее ключевым зве­ном передачи митогенных сигналов всех ЭФР-подобных пептидов и необходим для успешного функционирования всей системы.

Блокирование НЕR2/neu может сущест­венно замедлить или остановить рост опухолей, зависимых от подобных стимулов, однако эффективное использование биологически активных препаратов предусматривает предва­рительную оценку индивидуальной чувстви­тельности больных к данному виду лечения.

При применении герцептина общепринятым и наиболее адекватным методом оценки чувст­вительности является использование иммуно-гистохимического (ИГХ) окрашивания опухо­левых тканей на белок НЕR2/neu с последую­щей оценкой амплификации гена c-erbBВ-2 ме­тодом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Как правило, менее дорогостоящее ИГХ-исследование проводится в качестве пред­варительного общего скрининга, а FISH ис­пользуется в спорных случаях, когда ИГХ-метод не дает четко положительного или четко отри­цательного ответа. Подобный подход хорошо зарекомендовал себя в лечении больных РМЖ, позволяя обеспечить максимальную эффектив­ность лечения герцептином, избежав при этом неоправданных затрат на обследование. Что касается прогностического значения гиперэкспрессии или амплификации гена с-еrbB-2, то, несмотря на гигантский материал (к настоящему времени в разных лабораториях ми­ра обследовано более 12 тыс больных РМЖ), единого мнения о прогностической ценности НЕR2/neu пока нет. Некоторые авторы отмечают его неблагоприятное влияние на безрецидивную выживаемость больных с ранними стадиями РМЖ, другие не находят достоверной взаимосвя­зи этих показателей. Есть данные о том, что опухоли с амплифицированным геном НЕR2/пеи слабо реагируют на эндокринную те­рапию, но чувствительны к последующей химио­терапии. Считается также, что больным с НЕR2/neu-положительными опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии, чем больным с опухолями, не име­ющими повышенной экспрессии этого онкогена.

Наличие у НЕR-2/neu как внутриклеточ­ной, так и экстрацеллюлярной части приводит к тому, что в процессе димеризации возможны деградация молекулы рецептора и миграция его внешнего домена в межклеточную среду. Эта особенность и легла в основу разработки иммуноферментных систем для определения раство­римого НЕR-2/neu в сыворотке или в плазме крови. Уже опубликованы результаты, свиде­тельствующие о перспективности этого направ­ления, в первую очередь, для мониторинга эффективности лечения герцептином, тем не менее признается необходимость дальнейшего набора материала и выработки четких количест­венных критериев.

Система активации плазминогена — показа­тель метастатического потенциала РМЖ

Одно из фундаментальных свойств злокачественных опухолей — способность к метастазированию и инвазии. Важнейшим биохимическим меха­низмом этих процессов является разрушение ок­ружающей базальной мембраны и внеклеточно­го матрикса ассоциированными с опухолью протеазами, центральное место в котором занимает протеолитический каскад активации плазмино­гена в опухолевой ткани. В многоступен­чатой цепочке протеаз, ведущей к разрушению внеклеточного матрикса, ключевую позицию за­нимает активатор плазминогена урокиназного типа (uРА). Важную роль играет также находя­щийся на поверхности клеток рецептор uPА, по­скольку при связывании с ним способность uРА активировать плазминоген увеличивается. В це­лом процесс образования плазмина представля­ет собой циклическую амплификацию, регули­руемую по механизму обратной связи. Помимо uРА, в нем участвует также активатор тканевого типа (tРА), однако его роль при развитии опухо­лей, по-видимому, противоположна и сводится к разрушению опухолевых клеток и защите ок­ружающих тканей. Активность uPA и tPA подав­ляется 2 белковыми ингибиторами, принадлежа­щими к семейству серпинов, — РАI-1 и РАI-2.

Считается, что при опухолевом росте они также играют разную роль: РАI-1 защищает опухоле­вые клетки от саморазрушения, а РАI-2 тормо­зит протеолитические процессы во внеклеточ­ном матриксе. Различные компоненты системы активации плазминогена в ткани РМЖ могут находиться как на самих опухолевых клетках, так и на фибробластах стромы, инфильтрирую­щих опухоль лимфоцитах и макрофагах, эндоте-лиальных клетках, поэтому можно считать, что процесс активации плазминогена носит преиму­щественно паракринный характер. Уровень и соотношение экспрессии компо­нентов системы активации плазминогена в опу­холевой ткани могут служить показателем мета­статической и инвазивной активности опухоли, являясь вследствие этого биологически значи­мым фактором прогноза при злокачественных опухолях или показателем риска малигнизации доброкачественных новообразований. В доста­точно репрезентативных и многочисленных ис­следованиях продемонстрирована высокая про­гностическая значимость uРА и РАI-1 при РМЖ: риск рецидивирования или метастазирования даже при ранних стадиях заболевания возрастает в 1,5—3 раза, если уровень этих белков превыша­ет определенные пороговые значения.

Много­факторный анализ свидетельствует о том, что они являются независимыми факторами про­гноза. В связи с этим определение uРА или РАI-1 может быть рекомендовано у больных с ранни­ми стадиями РМЖ для выделения подгрупп с повышенным риском рецидивирования и(или) метастазирования, требующих более интенсив­ного лечения. Наиболее адекватным методом оценки уровня экспрессии компонентов системы акти­вации плазминогена в настоящее время считает­ся количественное иммуноферментное опреде­ление концентрации этих белков в цитозолях тканей. К сожалению, единые пороговые значения пока не установлены, хотя уже прово­дятся международные кооперированные иссле­дования в этом направлении.

Фактор роста эндотелия сосудов — показа­тель активности неоангиогенеза

В последние го­ды большое внимание уделяется проблеме не­оангиогенеза (формирования новых сосудов) в злокачественных опухолях. Уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может разви­ваться и расти без образования в ней разветвлен­ной сети капилляров, обеспечивающих снабже­ние клеток кислородом и питательными вещест­вами. Изучение молекулярных механизмов ан-гиогенеза позволило перейти от микроскопиче­ской оценки плотности сосудов в опухолевой ткани к исследованию конкретных молекул, участвующих в регуляции образования и роста новых сосудов. Важнейшим положительным ре­гулятором ангиогенеза бесспорно является фак­тор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor — VEGF). Доказано, в частно­сти, что VEGF играет ключевую роль в неоангиогенезе при РМЖ. Результаты ряда ретроспективных клиниче­ских исследований свидетельствуют о том, что экспрессия VEGF при РМЖ имеет существен­ное значение для прогноза заболевания, а также влияет на чувствительность опухолей к гормональному и лекарственному лечению. Его высо­кий уровень свидетельствует о неблагоприятном прогнозе как при раннем, так и при распростра­ненном РМЖ. Кроме того, в настоящее время активно создаются и исследуются новые препа­раты с антиангиогенными свойствами, и оценка активности VEGF-зависимого ангиогенеза мо­жет стать основой для их целенаправленного применения. Попытки использовать показатели содер­жания VEGF в крови (как в сыворотке, так и в плазме) в качестве адекватной замены тканевой экспрессии этого белка при оценке активности ангиогенеза в РМЖ и прогнозировании исхода заболевания и(или) эффективности терапии до настоящего времени большого успеха не имели.

Таким образом, благодаря успехам биохи­мии, молекулярной биологии и биотехнологии в настоящее время в арсенале исследователей и клиницистов имеется огромное количество биологически значимых показателей, которые могут помочь в прогнозе раннего РМЖ и выборе адъювантной терапии при распространенном процессе. Тем не менее большинство молекуляр­ных маркеров пока еще прочно не вошли в ру­тинную практику, что определяется высокой стоимостью подобных исследований и сложно­стью интерпретации данных одновременного анализа многих прогностических факторов.

Для клинического использования международными организациями в настоящее время рекомендова­но лишь несколько из них, эффективность и по­лезность которых имеют достаточно высокий уровень доказательности, а именно:

1. определе­ние РЭ и РП у всех первичных больных для ре­шения вопроса о целесообразности назначения эндокринной терапии;
2. оценка экспрессии (амплификации гена) НЕR2/neu у больных рас­пространенным раком, если планируется лече­ние герцептином;
3. рассматривается также воз­можность определения опухолевой концентра­ции РАI-1 и/или uРА для выявления группы с повышенным риском рецидивирования и ме­тастазирования среди больных с ранними стади­ями процесса.

С появлением новых высокопроизводи­тельных технологий, позволяющих одновре­менно в очень небольшом образце определять несколько десятков или даже тысяч показате­лей, особенно актуальными становятся выбор оптимального набора информативных тестов, который позволил бы при минимальной стои­мости обследования обеспечить максималь­ную эффективность лечения каждого больно­го, а также разработка адекватного алгоритма интерпретации результатов этого комплексно­го анализа.

Авторы: Е.С. Герштейн, Н.Е. Кушлинский, ГУРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН
Материал взят из журнала « Маммология», №1, 2005

источник