Ген p53 опухолевого супрессора человека p53 мутируется с высокой частотой при спорадическом раке молочной железы, а пациенты синдрома Li-Fraumeni, которые переносят мутации зародышевой линии в одном аллеле TP53, имеют высокую заболеваемость раком молочной железы. За 10 лет с момента публикации первого нокаута гена-супрессора мыши p53 мыши (обозначенного Trp53) было много известно о вкладе p53 в биологию и подавление опухоли в молочной железе с использованием трансгенных и выбитых мышей p53. Первоначальные мыши, не обладающие р53, не выявили фенотипа молочной железы. Однако исследования с использованием мышей с дефицитом BALB / c-Trp53 продемонстрировали фенотип замедленной инволюции и фенотип опухоли молочной железы. Вместе с другими исследованиями мутантных р53-трансгенов и р53-битрансгеников было достигнуто большее понимание роли р53 в инволюции, регуляции активности р53 гормонами, влияния штаммов мыши и генов-модификаторов на фенотип опухоли и сотрудничество между р53 и другими онкогенными путями, химическими канцерогенами и гормональной стимуляцией в опухолегенезе молочной железы. Обе трансгенные и выбитые мыши p53 являются важными инструментами для изучения рака молочной железы in vivo и еще не используются для разработки терапевтических стратегий при раке молочной железы.
Ген супрессора опухоли р53 (ТР53 у людей или Trp53 у мышей) имеет решающее значение для ингибирования развития опухоли во многих тканях. Это проявляется в эпителии молочной железы с высокой частотой мутаций в ТР53 при спорадических раках молочной железы человека [1]. В соответствии с этим явлением мутации зародышевой линии в p53 предрасполагают женщин к раку молочной железы. У пациентов с синдромом Li-Fraumeni (LFS), у которых примерно половина переносов мутаций в одном аллеле TP53 [2], страдают от высокой частоты рака молочной железы, причем ранний рак молочной железы составляет примерно половину опухолей наблюдается у женщин ОРС [3,4]. Более того, даже в контексте мутаций в генах восприимчивости к раку молочной железы BRCA1 и BRCA2 обнаружены высокие показатели мутации p53 [5,6]. Таким образом, р53, по-видимому, является критическим агентом в защите грудного эпителия от опухолевого генеза.
Способ, которым p53 выполняет свою роль супрессора опухоли, связан с различными клеточными процессами. Репертуар активности р53 включает в себя регулирование клеточного цикла, апоптоз, старение, облегчение репарации ДНК и антагонизирующий ангиогенез (рис.1). Многие из этих функций опосредованы транскрипционной активацией генов-мишеней с помощью р53 [7], таких как индукция остановки клеточного цикла посредством транскрипционной активации p21WAF1, ингибитора циклинзависимой киназы. Другие виды активности могут включать в себя белок p53 более непосредственно, такой как 3 ‘→ 5’ экзонуклеазная активность р53, которая может способствовать верности репликации ДНК [8].
Уровни белка р53 обычно очень низки из-за быстрого оборота, но в ответ на различные стрессовые стимулы, такие как повреждение ДНК или гипоксия, белок р53 стабилизируется и активируется для выполнения своих функций. Регуляция стабильности и активности р53 включает в себя множество белков, таких как антагонист MDM2, который связывает трансактивационный домен, а также мишеней р53 для убиквитинирования и деградации или киназ ДНК-ПК и АТМ, которые фосфорилируют р53 на нескольких своих многочисленных сайтах для пост- трансляционная модификация [9,10]. Таким образом, общий p53 ответ клетки зависит от интеграции сигналов и активности многих различных механизмов и белков. Важные последствия активности р53, потенциальная гибель клеток или промотирование опухоли требуют этой тонкости и множественности контролей.
При таком уровне контроля над функцией р53 неудивительно, что потеря или мутация одного аллеля р53 могут иметь серьезные последствия. Это относится к пациентам с LFS, которые в дополнение к раку молочной железы восприимчивы к широкому спектру типов опухолей [3,4]. Однако, в отличие от гипотезы Кундсона о двух ударах для генов-супрессоров опухолей, опухоли могут развиваться у мышей Trp53 +/-, сохраняя при этом функциональный аллель Trp53 дикого типа, что указывает на то, что p53 гаплоидентичен для подавления опухолей [11]. Снижение доз р53, которое возникает в результате гетерозиготности на генетическом уровне, было показано во многих тканях мыши, что привело к промежуточному уровню активности транскрипции, контролю роста и апоптозу по сравнению с клетками дикого типа и Trp53 — / — [12-14] , Это может привести к удержанию клеток, которые приобрели дальнейшие онкогенные мутации, что приводит к гаплоинтенсивности для подавления опухолей.
Таким образом, защита эпителия молочной железы от опухолевого генеза p53 может включать в себя множество различных процессов. Хотя мелкие детали механизмов и регуляции лучше всего решать в сильно управляемых системах in vitro, биологические последствия таких результатов необходимо проверить in vivo, где все сигналы от всей ткани и всего животного остаются нетронутыми. Поэтому исследования трансгенных и нокаутных мышей на роль р53 и других молекул при раке молочной железы не были сфокусированы на подробных механизмах, но были направлены на имитацию генетической восприимчивости к раку молочной железы, наблюдаемой у людей, и демонстрируя функциональную роль наблюдаемых молекулярных повреждений в конечной стадии заболевания человека. В то время как мыши с нокаутом Trp53 дали много информации о роли р53 в подавлении опухолей, инструменты, которые позволяют специфическую модуляцию молочной железы, значительно улучшились, а в некоторых случаях были необходимы для нашего понимания функции р53 и ее взаимодействия с другие молекулы в защите от рака молочной железы.
Функция p53 была генетически модифицирована у мышей несколькими способами (таблица 1). Целенаправленное нарушение гена Trp53 было выполнено несколькими группами [15-17]. Этот процесс удаляет несколько экзонов из эндогенного гена и приводит к отсутствию белка р53 во всех тканях мыши во время развития и взрослой жизни. Мыши, гомозиготные по нулевой аллеле Trp53 (Trp53 — / -), умирают в возрасте 4-6 месяцев, прежде всего от лимфом. Только на генетическом фоне BALB / c было обнаружено значительное количество опухолей молочной железы у мышей Trp53 +/-, имитирующих LFS человека [18].
Для изучения функции гена в конкретной ткани без осложнения смерти из-за других типов опухолей (например, лимфомы) или эмбриональной летальности тканеспецифическая делеция генов в молочных железах была достигнута с использованием условных нокаутов [19,20]. В этой системе ген, подлежащий удалению, модифицируется путем вставки сайтов рекомбинации (loxP или FRT) с обеих сторон гена и вводится в мышь в качестве целевой инъекции. Это не изменяет функцию гена до тех пор, пока не будет выражена рекомбиназа, которая рекомбинирует хромосому на двух вставленных сайтах рекомбинации, тем самым удаляя сегмент гена между ними. Тканеспецифическая экспрессия рекомбиназы (Cre для сайтов loxP и Flp для сайтов FRT) достигает специфической для ткани делеции гена.
Следующие промоторы используются для нацеливания на молочную железу: промотор кислотного белка сыворотки (WAP), который включается исключительно во время беременности и лактации [19]; промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), который экспрессируется конститутивно в молочной железе на низких уровнях, но также в ограниченном числе других тканей, включая слюнную железу, и который реагирует на гормоны [19]; и промотор гена кератина 14 человека (K14), который экспрессируется в эпителии многих тканей, включая молочную железу и кожу [21].
В то время как K14 экспрессируется в миоэпителиальных клетках и редко в эпителиальных клетках просвета молочной железы, экспрессия Cre под промотором K14 приводит к экспрессии репортерного гена lacZ как в просвете, так и в миоэпителиальных клетках, возможно, из-за активности промотора K14 в общем предшественнике [21 ]. Следует отметить, что промоторы, используемые для экспрессии рекомбиназ, могут приводить к постоянным генетическим изменениям в клетках, которые только временно экспрессируют рекомбинацию. Таким образом, промоутеры должны быть тщательно выбраны с учетом их активности на протяжении всего развития, а не только для взрослых типов тканей.
Хотя молекулярный подход является одним из способов нацеливания на изменения молочной железы, трансплантация эпителия молочной железы в очищенные жировые подушки является ценным альтернативным подходом для анализа эффектов делеции генов в эпителии молочной железы [22]. С помощью этой методики молочные протоковые зачатки 3-недельных (предварительно опушенных) мышей хирургически удаляются из брюшных молочных желез. Это оставляет жировую прокладку «очищенной» эпителия молочной железы, в которую можно разместить донорский эпителий. По мере взросления мыши донорный эпителий будет расти, чтобы заполнить молочную железу.
Трансплантация эпителия Trp53 — / — таким образом продемонстрировала роль р53 в защите от образования опухолей молочной железы в отсутствие других трансгенов [23]. Кроме того, отсутствие гормональных требований, влияющих на удаление генов или стимулирование экспрессии трансгена, означает, что могут быть изучены взаимодействия между гормональными факторами и делецией гена. Таким образом, исследования гормонального моделирования в опухолегенезе молочной железы в отсутствие функционального р53 изучались [23,24].
В то время как делеция тканеспецифических генов широко не применялась к исследованиям функции р53, для изучения функции р53 в молочной железе использовалась сверхэкспрессия экзогенных генов (т. Е. Трансгенов) под тканеспецифическими промоторами. p53 представляет собой тетрамерный белок, поэтому белок из мутантного аллеля может взаимодействовать с и нарушать функцию белка р53 из аллеля дикого типа с доминантно-негативным образом. Это было элегантно продемонстрировано у мышей путем размножения мышей, трансгенных для мутантов р53 (Val135) для мышей дикого типа и Trp53 — / -. Мутантный трансген способствовал ускорению развития опухоли у мышей с диким типом и Trp53 +/-, но не имел эффекта у мышей Trp53 — / -, что указывает на то, что его промотирование опухоли происходит только через нарушение функции р53 дикого типа [25].
Другие мутантные Trp53 гены были чрезмерно экспрессированы в молочной железе под контролем промотора WAP. Эти трансгены содержат точечные мутации, обычно встречающиеся в TP53 в опухолях человека, такие как мутант p53-R172H, которые обладают доминантно-отрицательными или функциональными свойствами, и, таким образом, в некоторых отношениях могут лучше представлять ситуацию человека, чем полное отсутствие гена продукт [26]. Однако использование промотора WAP, которое включается исключительно во время беременности и лактации, требует, чтобы мыши проходили по крайней мере один, а часто несколько раундов беременности и лактации, чтобы поддерживать трансгенную экспрессию. Альтернативным подходом является использование промотора MMTV, который выражен конститутивно в молочной железе, но этот промотор также реагирует на гормоны. Таким образом, когда трансгены управляются промоторами WAP или MMTV, невозможно рассекать гормональные события, которые могут взаимодействовать с функцией р53 в молочной железе и влиять на опухолегенез. На сегодняшний день промотор MMTV не использовался для введения модифицированных генов р53. Тем не менее, промотор MMTV использовался для привода многих онкогенов молочной железы, которые изучались в комбинации с Trp53-аллелем, как будет обсуждаться (см. Таблицу 3 позже).
Возникновение мутаций p53 при раке молочной железы и высокий уровень рака молочной железы у пациентов с LFS указывают на важную роль p53 в груди. Первоначальные исследования мышей с дефицитом р53 (Trp53 +/- и Trp53 — / -) [15-17], однако, не выявили какой-либо существенной функции для р53 в молочной железе. У мышей с дефицитом р53 не развивались опухоли молочной железы, и как лактация, так и инволюция оказались нормальными. Однако более тщательное исследование на клеточном уровне мышей дикого типа по сравнению с мышами Trp53 — / — показало роль для p53-зависимого апоптоза на ранних стадиях инволюции. Удаление щенков из лактирующей железы дикого типа индуцирует экспрессию p21WAF1, гена-мишеней p53, в течение 24-48 часов. Это выражение отсутствовало у мышей Trp53 — / -. Соответственно, инволюция у мышей Trp53 — / — была отложена при исследовании в раннем (2-5) периоде отлучения [27]. Другие работники также сообщили, что наблюдали меньшее количество апоптотических клеток в день 1 инволюции у мышей Trp53 — / — по сравнению с контрольными мышами [28]. Таким образом, р53 играет важную роль в индуцировании эпителиального апоптоза молочной железы в ответ на физиологический стимул.
Белок p53 также важен в реакции нормального эпителия молочной железы на повреждающие ДНК агенты, такие как γ-излучение, но на отзывчивость в значительной степени влияет гормональный статус животного. В нормальном покоящемся эпителии облучение всего тела мышей приводило к минимальному увеличению p53-зависимой транскрипции p21WAF1 и апоптоза. Однако лечение мышей экзогенными гормонами (беременная грудная клетка гонадотропина и гонадотропин человека) до облучения вызывало сильный ответ р53 [29]. В физиологической обстановке эта регуляция реакции р53 гормонами была продемонстрирована сильной индукцией p21WAF1 и апоптозом после облучения во время беременности и отлучения, но отсутствием реакции во время лактации и в девственном состоянии [30]. Отсутствие экспрессии p21WAF1 и апоптоза у аналогично обработанных животных Trp53 — / — показало, что эти процессы зависят от p53.
Это изменение активности р53 в молочной железе связано со многими уровнями регуляции. Уровни мРНК р53 изменяются на этапах развития, что говорит о гормональной регуляции транскрипции [27,29]. Однако девственная железа содержит высокие уровни мРНК р53 и, тем не менее, не вызывает реакции р53 на γ-излучение, что указывает на важность трансляционного и посттрансляционного регулирования. Экспрессия антагонистов p53, таких как MDM2, также варьируется в разных стадиях развития (Pinkas and Jerry, неопубликованные данные, 2002). Однако это не полностью объясняет вариации активности р53. Механизмы, с помощью которых гормоны модулируют функцию р53, еще не определены.
В то время как первоначальные мыши Trp53 — / — развивались нормально, они поддавались диапазону опухолей, прежде всего лимфом, в течение 6 месяцев. Опухоли молочной железы заметно отсутствовали [15,16]. Чтобы изучить возможность того, что ранняя смерть, вызванная лимфомой, может быть затенением развития опухоли молочной железы у мышей Trp53 — / -, BALB / c-Trp53 — / — эпителий молочной железы трансплантировали в очищенные жировые подушки хозяев дикого типа. В этой модели спонтанные опухоли молочной железы образовались в 60% разрастаний с латентностью 50 недель [18,23], что свидетельствует о том, что дефицит р53 может способствовать образованию опухолей молочной железы у мышей, а также у людей (табл. 2). Образованные опухоли были умеренно плохо дифференцированными аденокарцинами с высоким уровнем анеуплоидии. Однако длительная латентность и неполная пенетрация фенотипа указывают на необходимость проведения других генетических событий в дополнение к потере р53 для образования опухолей.
Мыши Trp53 +/- выжили намного дольше, чем мыши Trp53 — / -. Однако они также поддавались лимфомам и саркомам, но опухоли молочной железы составляли менее 1% опухолей у мышей 129 / Sv и C57BL / 6 × 129 / Sv мыши [31]. В противоположность этому, когда Trp53-аллель был перекрестно скрещен с штаммом BALB / c (девять поколений), который, как известно, более восприимчив к опухолевой опухоли молочной железы, спонтанные опухоли молочной железы имели место у 55% мышей Trp53 +/- [ 18]. Таким образом, генетические компоненты, взаимодействующие с дефицитом р53, должны присутствовать в BALB / c для стимулирования образования опухолей молочной железы, а BALB / c-Trp53 +/- могут служить уникальной моделью LFS [18]. Подобно опухолям трансплантата Trp53 — / -, эти опухоли были в основном аденокарцином, имели длительную латентность 8-14 месяцев, а большинство было анеуплоидом. Кроме того, потеря аллеля дикого типа Trp53 наблюдалась во всех исследованных опухолях молочной железы, что свидетельствует о том, что это важное совместное генетическое событие в опухолеобразовании [18]. Это похоже на наблюдение в LFS, где потеря гетерозиготности для TP53 происходила с высокой частотой при раке молочной железы [32].
Исследования с использованием вариаций этих двух моделей исследовали взаимодействия между р53 и гормонами, канцероген молочной железы 7,12-диметилбенз [а] антрацен (ДМБА) и γ-излучение в опухолегенезе молочной железы (таблица 2). Модель трансплантации Trp53 — / — была использована для изучения взаимодействия между гормональной стимуляцией и дефицитом р53 в опухолегенезе молочной железы. Хроническая гормональная стимуляция в виде изофлатов гипофиза увеличивала частоту опухоли от 60 до 100%, в дополнение к уменьшению латентности (от 50 до 37 недель) [23]. Это наблюдение указывает на то, что в отсутствие р53 гормональная стимуляция является очень мощным туморогенным стимулом. Действительно, дальнейшее исследование показало, что низкие дозы прогестерона, но не эстрогена, могут способствовать анеуплоидии в морфологически нормальных трансплантатах Trp53 — / — молочной эпителии [24].
Сотрудничество химического канцерогена DMBA с мутацией р53 или дефицитом р53 также продемонстрировано в нескольких ситуациях. Только лечение DMBA уменьшало латентность опухоли (50-35 недель) в Trp53 — / — выростах [23]. При введении в дополнение к гормональной стимуляции латентность была дополнительно снижена (25 недель). Сотрудничество наблюдалось также у мышей, несущих трансген p53-R172H. Этот трансген, с непрерывным размножением для стимулирования экспрессии из промотора WAP, привел к тому, что у мышей старше 1 года только 10-15% спонтанной опухоли молочной железы. Однако, используя изофлаты гипофиза для стимуляции максимальной экспрессии трансгена, присутствие мутантного трансгена p53-R172H увеличивало нагрузку и частоту опухоли и уменьшало латентность опухолей, индуцированных введением DMBA [33]. Джерри и др. Также сообщили о тенденции к сотрудничеству между обработкой Trp53 +/- и DMBA с стимуляцией гипофизом. [34], но он не был статистически значимым (Таблица 2).
Подобно спонтанному формированию опухоли молочной железы, способность γ-излучения стимулировать опухолегенез молочной железы у мышей Trp53 +/ сильно зависит от фона штамма мыши. С помощью Trp53-аллеля с обратной связью от одного до шести поколений на штамм DBA / 2 или BALB / c γ-излучение значительно увеличивало частоту опухолей молочной железы у мышей BALB / c-Trp53 +/-, но не в DBA / 2- Trp53 +/- [35]. Это усиливает важность генов-модификаторов, которые могут изменять фенотипы мутаций восприимчивости опухоли, таких как Trp53-.
В дополнение к LFS идентификация двух генов восприимчивости к раку молочной железы, BRCA1 и BRCA2, привела к многочисленным попыткам имитировать мышей восприимчивость к раку молочной железы у людей, вызванную мутациями в этих генах, и понять механизмы, с помощью которых они вносят вклад в канцерогенез молочной железы. В связи с этим было создано пять штаммов мышей с нокаутом Brca1 (рассмотрено в [36]), что свидетельствует о том, что полный дефицит Brca1 вызывает эмбриональную летальность. Мыши Brca1 +/- развивались нормально, но, в отличие от людей, несущих мутации BRCA1, не проявляли повышенной восприимчивости к карциноме молочной железы, напоминающей гетерозиготных мышей p53 и LFS.
Используя мышей с мутациями зародышевой линии, Cressman et al. продемонстрировала кооперативность между p53 и Brca1 в формировании опухоли молочной железы (таблица 3), причем 10% мышей Brca1 +/- Trp53 — / — развивали карциномы молочной железы по сравнению с 0% мышей Brca1 +/- Trp53 + / + [37]. С развитием условных нокаутов Xu et al. смогли продемонстрировать более элегантно и чутко сотрудничество между этими двумя генами. У мышей с одной зародышевой линией и одним условным мутантным аллелем Brca1 (Brca1Ko / CoMMTV-Cre) опухоли молочной железы развивались примерно через 1 год. Добавление одной мутации зародышевой линии в Trp53 (Brca1Ko / CoMMTV-CreTrp53 +/-) ускорило формирование опухоли молочной железы до 6-8 месяцев, и большинство этих опухолей показали потерю аллеля дикого типа Trp53 [38]. Таким образом, мутации в Brca1 и Trp53 сильно взаимодействуют в опухолегенезе молочной железы.
Первые попытки исследовать мышей с нокаутом Brca2 также обнаружили, что мутация была эмбриональной смертельной. Однако недавнее поколение условных мышей с нокаутом Brca2 с экспрессией Cre, экспрессирующей промотор K14, позволило исследовать дефицит Brca2 в молочной железе [21]. Поразительно, что K14cre, женщины Brca2Co / Co не развивали эпителиальных опухолей в течение 900 дней наблюдения, но отсутствие р53 (также условно выбитое) приводило к тому, что у всех мышей, развивающихся как карциномы кожи или молочной железы, на 300 дней. Дефицит одного аллеля Trp53 был достаточным для стимулирования образования опухоли молочной железы и кожи, и все опухоли потеряли аллель дикого типа Trp53. Нарушение пути р53, таким образом, является ключевым в отношении рака молочной железы, связанного с Brca2 у мышей [21]. Это согласуется с раком молочной железы человека, где мутации в р53 наблюдаются в значительной части раковых опухолей BRCA1 и BRCA2 [5,6]. Интересно отметить, что большинство опухолей молочной железы, наблюдаемых в модели K14cre, Brca2Co / CoTrp53Co / Co, были карциномами с базальными или миоэпителиальными клетками, что, возможно, отражает доминирующую картину экспрессии K14-промотора в миоэпителиальных клетках [21].
В дополнение к генам восприимчивости к раку молочной железы р53 изучали для кооперативности с путями, активированными при спорадическом раке молочной железы. Были получены трансэригенные мышечные трансгенные онкогены, вовлеченные в рак молочной железы человека, такие как HER-2 / Neu, Wnt1 и c-myc, которые развивают высокую частоту спорадических карциномы молочной железы. Путем скрещивания этих мышей с мутантными мышами Trp53 или нулевыми мышами для генерации двойных трансгенных мышей можно было непосредственно продемонстрировать кооперативную активность (таблица 3). Например, HER-2, член семейства рецепторов эпидермального фактора роста, сверхэкспрессируется примерно в 20% случаев рака молочной железы человека и связан с плохим прогнозом [39].
Трансгенные мыши, экспрессирующие крысиную раку дикого типа под промотором MMTV (MMTV-neu), развивают опухоли молочной железы со средней латентностью 234 дней, которые имеют высокую частоту missense-мутаций в Trp53 [40]. Кооперативность между путями Neu и p53 была четко продемонстрирована путем введения мутантного p53-трансгена p53-R172H в этих мышей, что уменьшало латентность опухоли до 154 дней [40]. Таким образом, это исследование у трансгенных мышей продемонстрировало сильную кооперативность между двумя генетическими поражениями, характерными для рака молочной железы человека, и продемонстрировало, что мутация p53 является важным событием в нейро-опосредованном онкогенезе.
Аналогичная кооперативность наблюдалась между р53 и инсулиноподобным фактором роста. Мыши, сверхэкспрессирующие аналог инсулиноподобного фактора роста-I, трансген WAP-des (1-3) IGF-I (WAP-DES), продемонстрировали 80% случаев опухолей молочной железы с латентностью 21 месяц. Это ускоряется до 14 месяцев в сочетании с мутантным p53 трансгеном p53-R172H [41]. Кооперативность между p53 и Wnt-тропом исследовалась с помощью Trp53-аллеля. Женские мыши, трансгенные для онкогена молочной железы Wnt1, развивают опухоли молочной железы со средней латентностью 23 недели. Наследование одного дефектного аллеля Trp53 не приводило к какой-либо повышенной восприимчивости в этой модели, но латентность была уменьшена вдвое до 11,5 недель с двумя зародышевыми Trp53-аллелями [42]. У мышей MMTV-ras, которые развивают как опухоли молочной железы, так и опухоли слюны, будучи Trp53 +/- уменьшали латентность опухоли с 8,5 до 6,3 месяцев с небольшим изменением спектра опухоли [43].
В дополнение к уменьшению латентности опухоли дефекты пути р53 в вышеупомянутых моделях изменили гистологический класс опухолей молочной железы. В то время как опухоли neu были эуплоидами, битурангенные опухоли neu / p53-R172H имели более высокий гистологический признак и проявляли анеуплоидию [40]. У WAP-DES / p53-R172H битрингенные опухоли показали более высокую долю опухолей с анеуплоидией, и в этих опухолях они показали более высокую долю анеуплоидных клеток, чем в трансгенных опухолях WAP-DES [41]. Аналогичные изменения наблюдались как в опухолях слюны, так и в молочной железе MMTV-ras с потерей р53 [43]. В модели Wnt1 опухоли молочной железы, не имеющие р53, проявляли повышенную геномную нестабильность с анеуплоидией, амплификациями и делециями, как показано с помощью анализа кариотипа и сравнительной геномной гибридизации [42]. Общей чертой опухолей молочной железы, не имеющих функционального р53, независимо от движущей онкогенной силы, является поэтому геномная нестабильность, которая согласуется с профилем р53 как «хранителем генома».
Геном генотипа p53 также влияет на скорость роста опухоли в нескольких из этих моделей. Опухоли молочной железы у мышей Wnt1 / Trp53 — / — проявляют более быстрый рост после установления по сравнению с опухолями Wnt1 с функциональным р53. Это было связано не с уменьшением апоптоза, поскольку не было никакого эффекта генотипа р53 на уровнях апоптоза. Однако опухоли Trp53 — / — содержали больше митотических фигур и имели больше клеток в S-фазе, чем опухоли Wnt1, что указывало на повышенную скорость пролиферации в качестве основного дефекта [44]. Более высокие уровни пролиферации наблюдались также в MMTV-ras / Trp53 — / — битрансгенных опухолях по сравнению с MMTV-расом без изменения уровней апоптоза [43]. Это контрастирует с исследованиями на животных в других тканях, где ускоренный рост опухоли из-за потери р53 происходит в основном за счет потери нормальной апоптотической функции [45,46]. Механизмы, при которых потеря р53 влияет на прогрессирование опухоли, может, таким образом, различаться в зависимости от типа ткани и / или от задействованных онкогенных путей.
Исследован механизм, с помощью которого p53 ингибирует рост опухоли в модели Wnt1. Экспрессия профилей Wnt1 и Wnt1 / Trp53 — / — опухолей молочной железы продемонстрировала, что опухоли Trp53 — / — показали измененную экспрессию нескольких регуляторных генов регуляции пролиферации. Экспрессия p21WAF1 [47], гена-мишени p53, была снижена в опухолях у мышей Wnt1 / Trp53 — / — по сравнению с мышами Wnt1. В соответствии с этим путем опухоли Wnt1 / p21WAF1 +/- показали увеличение скорости роста опухоли по сравнению с опухолями Wnt1 [48]. Таким образом, ингибирование роста опухоли p53 может быть опосредовано p21WAF1.
В то время как некоторые эффекты p53 на фенотип опухоли были четко идентифицированы, механизмы, с помощью которых p53 защищает от рака в нормальных молочных железах, труднее выявить. «Суперактивный» мутант p53-трансген, p53-R172L, экспрессируемый под промотором WAP, приводит к повышенным показателям апоптоза в нормальных молочных железах [49,50]. Интересно, что это трансгенное замедленное начало опухоли молочной железы, индуцированное DMBA [50], и у трансгенных мышей, экспрессирующих трансформирующий фактор роста α [26]. В этих моделях защита от рака молочной железы с помощью р53 может быть, таким образом, вызвана удалением генетически поврежденных клеток с помощью p53-зависимого апоптоза.
Напротив, гиперплазии в молочных железах Wnt1 не показали изменения скорости апоптоза с генотипом Trp53 [44], что свидетельствует о том, что апоптоз, опосредованный p53, не участвует в профилактике опухолей в этой модели. Кроме того, в этой же модели недостаток в p21WAF1 (Wnt1 / p21WAF1 — / — и Wnt1 / p21WAF1 +/-) не смог имитировать ускорение из-за потери р53 [48]. Поэтому в модели Wnt1, по-видимому, защита от опухолевого генеза p53 происходит за счет механизмов, отличных от апоптоза или опосредованного p21WAF1 клеточного цикла, такого как сохранение геномной стабильности.
Хотя p53 сотрудничает со многими моделями, это не относится ко всем моделям. Самки мыши, переносящие трансген MMTV / c-myc, развивают карциномы молочной железы в возрасте 8-10 месяцев, при этом у отдельных мужчин развиваются лимфомы. Однако, когда присутствует только один аллель p53, мыши развивают агрессивные лимфомы, которые, по-видимому, требуют потери аллеля дикого типа p53. Напротив, не было признаков ускорения опухолей молочной железы, и три четверти опухолей молочной железы, которые имели форму, сохранили аллель дикого типа [51], что указывает на то, что кооперативность между c-myc и p53 зависит от типа ткани. Независимо от генотипа p53, опухоли c-myc показали изменения в плоидности и хромосомных аберрациях [52]. Отсутствие ускорения опухоли в присутствии хромосомной нестабильности, вызванной c-myc, и отсутствие роли апоптоза и клеточного цикла p21WAF1 в модели Wnt1 свидетельствуют о том, что поддержание геномной стабильности может быть главной ролью для профилактики р53 в профилактике опухолей молочной железы.
Функцию белка р53 можно также аннулировать экспрессией вирусных онкогенов SV40. Хотя эти вирусные белки не вовлечены в рак молочной железы человека, вирусные белки имитируют изменения, связанные с раком молочной железы человека. По этой причине было создано несколько трансгенных мышей для изучения опухолевого генеза молочной железы [53-57]. Однако есть несколько осложнений с этими моделями с точки зрения понимания функции р53 при раке молочной железы.
Первые трансгенные вирусы SV40 содержали раннюю область SV40, которая продуцирует множество продуктов гена, включая большой T-антиген, который функционально инактивирует как pRb, так и p53, и включает в себя небольшой t-антиген, который ингибирует серин / треонинфосфатазу PP2A. Поэтому эти модели не просто влияют на функцию р53, и только недавно вклад различных компонентов этих генных продуктов был полностью исследован.
Недавнее исследование Goetz et al. [58] сгенерировали несколько трансгенных линий WAP-SV40, которые производят либо только большой T-антиген (WAP-SVT), только малый t-антиген (WAP-SVt), либо N-концевые усеченные большие T-антигены (WAP-SVBst-Bam). Все эти линии развили опухоли молочной железы с более низкой частотой, чем исходные мыши, экспрессирующие как большие T, так и малые t-антигены (SVT / t) (100, 64, 6-12 и 0% для SVT / t, SVT, SVt и SVBst- Bam соответственно) [57,58], что указывает на многие сотрудничающие функции в раннем геноме SV40. Особо следует отметить, однако, отсутствие опухолей молочной железы из-за трансгена SVBst-Bam, который сохраняет распознанные pRb-связывающие и p53-связывающие части генома SV40. Напротив, только небольшой т-антиген мог приводить к образованию опухоли. Таким образом, p53 и pRb-связывающие активности большого Т-антигена требуют взаимодействия с малым t-антигеном и N-концевой областью большого Т-антигена для индуцирования образования опухолей молочной железы [58].
Большинство моделей мышечной массы рака молочной железы не проявляют метастатического заболевания. Однако мыши, экспрессирующие ранний геном SV40 под контролем компонента C3 (1) промотора белка, связывающего стероидный протеин крысы (C3 (1) / TAG) [56], развивают очень агрессивные опухоли молочной железы всего за 16 недель, причем около 15 %, показывающие метастазы в легкие.
В этой модели мыши, являющиеся Trp53 +/-, существенно не изменяли латентность или не приводили к потере оставшегося аллеля Trp53. Однако это привело к более агрессивным опухолям молочной железы, о чем свидетельствуют увеличение числа и размеров метастазов, чем у мышей TAG-Trp53 + / + [59]. Таким образом, потеря р53 приводит к опухолям более высокой степени, более анеуплоидии в первичной опухоли и способствует метастазам. Это согласуется с более низким прогнозом пациентов с p53-негативными / мутантными опухолями по сравнению с теми, у кого нет мутаций p53. Защита от метастазов p53 может быть опосредована его индукцией генов ангиогенеза, но эти характеристики р53 до настоящего времени не были полностью изучены в моделях трансгенных / нокаутных мышей.
Широко распространенный принцип химиотерапии заключается в том, что клетки умирают из-за апоптоза и что отсутствие р53 может привести к резистентности к апоптозу и, следовательно, к химиотерапии. Однако это не было четко продемонстрировано для негематологических опухолей [60]. Действительно, p53-опосредованный апоптотический ответ на γ-излучение опухолей мыши был изменен среди тканей [61]. В индуцированных DMBA опухолях мышей молочной железы облучение всего тела способно индуцировать экспрессию и апоптоз р53. Это контрастировало другие типы опухолей, такие как аденомы печени и легких, где ни экспрессия р53, ни апоптоз не вызывались излучением. Таким образом, хотя роль p53 в индуцировании апоптоза в ответ на излучение (и, вероятно, другие химиотерапевтические агенты) варьируется в зависимости от типов тканей и опухолей, оказалось, что опухоли молочной железы, сохраняющие p53 дикого типа, являются одним типом, в котором p53 важен [61] ,
Barrington et al. [62] использовали модели трансгенных мышей для изучения роли опосредованного p53 апоптоза в регрессии опухоли in vivo нескольких химиотерапевтических агентов. L-744,832, мощный и селективный ингибитор фарнезилтрансферазы, который катализирует обязательную стадию активации Ras-белка, приводит к быстрой регрессии опухолей молочной железы и слюны у трансгенных мышей MMTV-ras. Это происходило за счет индуцирования высоких уровней апоптоза, а опухоли, возникающие у мышей ras / Trp53 — / -, регрессировали, по крайней мере, так же эффективно, как опухоли опухоли ras / Trp53 + / +, что указывает на то, что ответ был в значительной степени p53-независимым [62]. Это контрастирует с эффективностью опухолей рак / Trp53 — / — слюны доксорубицина, который не способен ингибировать рост опухоли, и паклитаксела, который ингибирует рост, но не приводит к регрессии [63]. Тем не менее оба этих агента были эффективны в опухолях ras / Trp53 + / +. Интересно, что ни доксорубицин, ни паклитаксел эффективно индуцировали апоптоз, а скорее изменяли распределение клеток в клеточном цикле. Таким образом, pock knockout и трансгенные модели могут быть использованы для изучения механизмов и эффективности терапевтических агентов в присутствии и отсутствии р53. Использование мышиных моделей таким образом, вероятно, предоставит ценную информацию для клиники по пошиву терапевтических агентов, которые нацелены на конкретные молекулярные поражения рака.
В дополнение к изменению клеточного цикла и апоптоза в качестве средства медиации эффективности лечения экспрессия p53 в опухолях молочной железы также может изменить эффективность иммуномодулирующей генной терапии. У мышей, несущих опухоли, индуцированные PyMT, интраокуральная инъекция аденовирусов, несущих либо IL-2, либо р53, способна задерживать рост опухоли, но при одновременном лечении обоими вирусами была получена регрессия в 65% опухолей без токсичности IL-2 [64] , Механизмы, с помощью которых p53 усиливает эту терапию, неясны, но могут быть связаны с ингибированием роста, что позволяет расширить цитотоксический ответ Т-лимфоцитов на опухоли. Только небольшой процент опухолевых клеток в этой системе инфицирован аденовирусом, поэтому, в то время как противоопухолевый рост может быть опосредован апоптозом, он, вероятно, также будет включать большой наблюдаемый эффект и, возможно, механизмы антиангиогенеза [64].
Хотя начальные исследования нокаутных мышей Trp53 не предполагали, что p53 играет важную роль в молочной железе мыши, теперь ясно, что p53 играет важную роль в нормальной физиологии и опухолегенезе у мыши. Таким образом, нокаутные и трансгенные мыши с модифицированными функциями р53 будут полезными инструментами для понимания биологии рака молочной железы и ответа на терапию. p53 может опосредовать апоптоз в молочной железе в ответ на физиологические и экзогенные стрессы. Дефицит только р53 в чувствительной генетической среде является достаточным для развития мышечной опухоли молочной железы у мышей, и также было показано, что он является ключевым в формировании рака молочной железы в контексте дефицита Brca1 и Brca2. Поэтому мы теперь можем моделировать у мышей три сильных синдрома восприимчивости к раку груди человека.
Дефицит р53 изменяет биологию опухоли, способствует агрессивности, быстрому росту и генетической нестабильности. Недостаток p53 мыши взаимодействует с другими онкогенными событиями, важными для рака молочной железы человека, ускоряя образование опухоли молочной железы. Идентификация дальнейших путей (и, следовательно, генов-модификаторов), с которыми взаимодействует дефицит р53, в сочетании с механизмами понимания, регулирующими активность р53, значительно улучшит наше понимание биологии рака молочной железы и нашу способность предотвращать ее. С учетом сложности биологии опухолей и паракринной активности р53, таких как антиангиогенные активности, использование трансгенных и выбитых мышей р53 обеспечивает важные инструменты in vivo для понимания и разработки терапевтических стратегий.
DMBA = 7,12-диметилбенз [a] антрацен; IL = интерлейкин; K14 = кератин 14; LFS = синдром Ли-Фраумени; MMTV = вирус опухоли молочной железы мыши; TP53 = ген супрессора опухоли человека p53; Trp53 = ген супрессора опухолей мыши p53; WAP = сывороточный кислотный белок; WAP-DES = WAP-des (1-3) инсулиноподобный фактор роста-I трансген.
Поддержка была оказана премией Министерства обороны по борьбе с раком молочной железы номер DAMD17-00-1-0632 (DJJ) и номером премии DAMD17-01-1-0315 (ACB), который ведется Управлением медицинской экспертизы армии США (Fort Detrick, MD, США) и Национальный институт здравоохранения R21CA87531.
Активация р53 и ответов. Белок р53 может существовать в нескольких состояниях внутри клеток. В нормальных условиях уровни белка р53 очень низки из-за быстрого оборота. Активация клеточных стрессовых путей вызывает ковалентную модификацию и тетрамеризацию р53, стабилизируя белок и приводя к накоплению в ядре. Клеточный результат зависит от баланса факторов, присутствующих в клетках, которые могут противодействовать или стимулировать конкретные реакции.
Генетические изменения гена Trp53 у мышей
WAP, сывороточный кислотный белок.
фенотипы опухолей р53 и мутационные опухоли молочной железы
DMBA, 7,12-диметилбенз [a] антрацен; NT, без лечения; Pit Stim, гормональная стимуляция, обеспечиваемая изопропанами гипофиза; WAP, сывороточный кислотный белок.
Сотрудничество р53 с другими трансгенами в опухолегенезе молочной железы
LOH, потеря гетерозиготности; MMTV, вирус опухоли молочной железы мыши; WAP, сывороточный кислотный белок; WAP-DES = WAP-des (1-3) инсулиноподобный фактор роста-I трансген.
источник
Как свидетельствуют исследования последних лет, РМЖ является гетерогенным заболеванием [2; 3]. Выявление все новых и новых молекулярно-генетических и иммунногистохимических маркеров и их корреляций позволяет индивидуализировать тактику лечения больных [1]. Ключевыми белками, участвующими в управлении апоптозом, являются белки семейства BCL-2 и супрессор опухолевого роста р53. Частота встречаемости экспрессии BCL2 (BCL2+) составляет, по данным разных авторов, от 54,1 % до 75,7 % [10; 9]. Некоторыми авторами проведены исследования по ассоциации BCL2+ с тем или иным молекулярно-биологическим подтипом РМЖ. Так, например, по данным [4], у 70 % больных ТНР выявлено отсутствие экспрессии BCL2 (BCL2-), что коррелировало с высокой пролиферативной активностью опухоли. Эти же данные о достаточно низкой экспрессии BCL2 подтверждены и в других исследованиях, где, помимо низкого уровня экспрессии BCL2, при ТНР отмечено высокое содержание p53 и высокая частота мутаций BRCA1 [8; 11]. Клинико-морфологическое исследование на материале 61 пациентки [12] выявило, что BCL2+ ассоциировано со старшим возрастом, постменопаузой, люминальным подтипом опухоли (особенно А), отсутствием гиперэкспресии или амплификации гена HER2neu, низкой или средней степенью ее злокачественности. При этом средний возраст больных BCL2+ достоверно выше, чем больных BCL2- (62 года против 53). А вот экспрессия р53 (р53+), по данным литературы, наоборот, связана с негативными рецепторами эстрогенов, HER2neu+ и высокой степенью злокачественности опухоли [5]. Так, повышенная экспрессия Всl-2 при РМЖ коррелирует с наличием в опухоли рецепторов эстрогенов и прогестерона [7]. По мнению Callagy G. и соавторов, это объясняется положительной эстроген-рецептор-зависимой регуляцией экспрессии Bcl-2 [6]. Таким образом, данные литературы по частоте встречаемости и корреляции экспрессии BCL2 и р53 с молекулярно-биологическими подтипами РМЖ носят разрозненный характер и касаются в основном ТНР. Более того, результаты исследований часто мало сопоставимы, ввиду того, что принципы деления РМЖ на подтипы менялись с течением времени (St.Gallen 2011; 2013).
Материалы и методы исследования
Была изучена экспрессия маркеров р53 и bcl-2 в клетках РМЖ 95 пациенток с различными молекулярно-биологическими подтипами с помощью иммуногистохимического метода. Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Использованные в работе первичные антитела и их разведения представлены в табл. 1.
Панель использованных в исследовании антител
Буфер для «демаскировки антигенов»
Нормальный и мутантный тип р53
10 мМ Tris, 1 мМ EDTA (рН 9,0)
10 мМ Tris, 1 мМ EDTA (рН 6,0)
Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 65 0С, восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97 0С и дальнейшее охлаждение до 65 0С. Затем стекла промывались в течение 1–3 минут TBS-буфером (Dako) и помещались в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40. В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров: 1) опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реакция с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25 %, и положительной по р53, если было окрашено более 25 % ядер опухолевых клеток. 2) опухоль считали отрицательной по bcl-2, если в ткани опухоли отсутствовала цитоплазматическая реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25 %, и положительной по bcl-2, если было окрашено более 25 % опухолевых клеток. Распределение больных по биологическим подтипам осуществлялось на основании рекомендаций Панели экспертов St.Gallen (2013) и практических рекомендаций RUSSCO (2013). Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., США) и MedCalc (версия 9.3.5.0).
Результаты исследования и их обсуждение
Из 95 пациенток у 26 (27,4 %) был определен люминальный А – подтип, у 33 (34,7 %) – люминальный В – подтип, у 15 – HER2neu+ (15,8 %), у 21 – ТНР (22,1 %). Данные по экспрессии р53 и bcl-2 представлены в табл. 2.
Экспрессия р53 и bcl-2 у больных с различными молекулярно-биологическими подтипами РМЖ
* – различия достоверны в отношении люминального А подтипа РМЖ (p ≤ 0,05)
¹ – различия достоверны в отношении люминального В подтипа (p ≤ 0,05)
Проведенное исследование выявило, что практически одинаково часто гиперэкспрессия р53 наблюдалась при люминальном В и Her2neu+ подтипах РМЖ и несколько снижается при ТНР. Накопление р53 при люминальном А – подтипе встречалось в 2 раза реже, чем при ТНР, и в 2,5 раза и 2,7 раза реже, чем при люминальном В и Her2neu+ РМЖ, соответственно. При этом степень ядерной реакции с антителами p53 в ткани опухоли и количество окрашенных клеток отличались. Так, при люминальном А – подтипе клетки стромы опухоли и инфильтрирующие опухоль лимфоциты вообще не окрашивались антителами к р53. Разброс количества окрашенных клеток при данном подтипе находился в пределах от полного отсутствия окрашивания ядер опухолевых клеток до 30 %. Такая же интенсивность окрашивания опухолевых клеток была и при ТНР. А вот при люминальном В разброс клеток по экспрессии данного маркера находился в пределах от 50 % ядер опухолевых клеток до 90 %, в среднем составив 76,8 ± 7,7 %. При HER2neu+ РМЖ отмечалась разнообразная картина. У половины больных процент позитивных клеток превысил уровень «cut-off», но не вышел за пределы 30 %. У другой половины практически все опухолевые клетки имели ядерное окрашивание антителами к р53. В каждом из исследованных случаев отмечалось положительное окрашивание антителами к bcl-2 инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, что являлось для нас внутренним положительным контролем. Среднее содержание опухолевых клеток, положительных по экспрессии bcl-2, в опухолях с люминальным А – подтипом составило 83,5 ± 8,4 %, где разброс находился в пределах от 60 % до 95 %. При люминальном В подтипе среднее содержание bcl-2 положительных опухолевых клеток составило 74,5 ± 3,7 %, где разброс находился от 60 % до 85 % клеток. При Her2neu+ РМЖ количество опухолевых клеток было существенно меньше, по сравнению с люминальными подтипами, и не превысило 30 %. При THР отмечалась такая же разноплановая картина, как и при изучении ядерного окрашивания антителами к р53. У половины больных количество опухолевых клеток, окрашенных антителами к bcl-2, не превышало 30 %, у оставшихся больных в среднем составило 70 %. Обнаружены некоторые различия и в интенсивности окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток в зависимости от молекулярного подтипа РМЖ. Так, при люминальном А – подтипе, как правило, цитоплазма имела яркую или среднюю интенсивность окрашивания, при люминальном В – подтипе у 17 из 25 позитивных случаев имели среднюю интенсивность окрашивания, у 4 – слабую и у 4 – цитоплазма была ярко окрашена антителами к bcl-2. При Her2neu+ РМЖ цитоплазма имела слабую интенсивность окрашивания, при THР одинаково часто была отмечена интенсивность окрашивания слабая и средняя. Таким образом, проведенное исследование экспрессии bcl-2 выявило закономерность снижения частоты позитивных случаев окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток с изменением рецепторного статуса опухоли, а именно, снижение в несколько раз числа позитивных случаев при THР и Her2neu+ подтипах РМЖ.
Рассмотрев соотношение числа положительных случаев по экспрессии p53 к случаям положительной экспрессии bcl-2, выявлено, что наименьшее соотношение (0,25) отмечено при люминальном А молекулярном подтипе, когда при повышении доли опухолей положительных по экспрессии bcl-2 отмечено снижение числа опухолей, позитивно окрашенных антителами к p53. Несколько выше этот показатель отмечен при ТНР и люминальном В – подтипе, составив 0,6 и 0,83 соответственно. Обратная зависимость наблюдалась при Her2+ РМЖ, составив 2, где отмечено преобладание доли опухолей, позитивных по экспрессии p53 над bcl-2+.
Таким образом, проведенное исследование подтвердило различие в уровне экспрессии рецепторов белков, участвующих в процессе апоптоза: p53 и BCL-2. Полученные результаты в большинстве своем не противоречат данным литературы. Однако, по нашим данным, уровень экспрессии р53 при люминальных подтипах различен. Если при люминальном А – подтипе он традиционно низкий, то при люминальном В – подтипе, наоборот, высокий и сравним с таковым в гормон-негативных опухолях. На наш взгляд, это объясняется прежде всего неоднородностью люминального В – подтипа. И высокий уровень экспрессии р53 при нем обеспечивается за счет гормон-позитивных опухолей, ассоциированных с гиперэкспрессией или мутацией Her2neu. Скорее всего, именно HER2neu+ статус опухоли наиболее сильно коррелирует с высоким уровнем экспрессии р53, что объясняет его снижение при ТНР. Этот же факт неоднородности люминального В – подтипа объясняет и достоверное снижение экспрессии bcl-2 в люминальных В – опухолях по сравнению с люминальным А – подтипом. Таким образом, полученные результаты предполагают дальнейшие исследования в этом направлении, с целью выявить более специфические различия в молекулярном портрете РМЖ.
Ващенко Л.Н., д.м.н., профессор, руководитель отделения опухолей мягких тканей и костей, ФГБУ «РНИОИ», г. Ростов-на-Дону;
Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник Южного научного центра РАН, г. Ростов-на-Дону.
источник
Особенности экспрессии маркера пролиферации KI-67 и мутантного гена апоптоза P-53 в тканях рака молочной железы
Основные факторы развития рака молочной железы. Цитологическая и патологоанатомическая диагностика: техника пункции и этапы макроскопического исследования материала. Определение содержания стероидных гормонов, маркеров пролиферации, белков-супрессоров.
1. Факторы, способствующие развитию рака молочной железы
2. Методы диагностики рака молочной железы
3. Цитологическая и патологоанатомическая диагностика рака молочной железы
3.1 Техника пункции молочной железы
3.2 Основные этапы макроскопического исследования материала, удаленного в ходе операции на молочной железе
3.3 Цитологические формы рака молочной железы
3.4 Гистологическая характеристика рака молочной железы
3.5 Значение определения содержания стероидных гормонов, маркеров пролиферации, белков-супрессоров
4. Результаты собственных исследований
Список использованных источников
рак молочный гормон пролиферация
В структуре онкологических заболеваний женского населения планеты рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время — одна из наиболее агрессивных и относительно часто встречающихся форм злокачественных новообразований. Ежегодно в мире выявляют до 1 млн. новых случаев [4]. К сожалению, показатели заболеваемости неуклонно растут, особенно в промышленно-развитых странах, в регионах с неблагоприятной экологической обстановкой, в том числе и в Беларуси [10]. По данным ВОЗ, ежегодно регистрируется порядка 570 тысяч новых случаев этого заболевания. При этом каждые 15 минут регистрируется случай рака молочной железы в среднем у 5 женщин, и 1 женщина умирает от этого заболевания, женщины трудоспособного возраста составляют 60%. Заболевание возникает в любом возрасте, но чаще в возрасте от 45 до 65 лет, у женщин моложе 40 лет встречается редко [12]. Тревожным фактом является то, что количество больных в возрасте 30 — 40 лет постоянно растет. По данным В.И.Тарутинова, ожидается, что ближайшие 10 лет этим заболеванием будут страдать около 5 млн. женщин в мире [5].
Рак молочной железы — злокачественное новообразование, обычно развивающееся из эпителия млечных протоков. Типичной формой рака молочной железы является узловая. Локализуется опухоль чаще всего в верхненаружном квадранте или на границе двух верхних квадрантов. Для рака молочной железы обычно характерны два способа метастазирования: лимфогенно- в регионарные лимфоузлы, и гематогенно — в кости, легкие, печень, яичники, головной мозг[3,6].
Усилия онкологов, направленные на борьбу с раком молочной железы, еще не дают ожидаемого эффекта. В связи с тем, что более 50 % больных злокачественными новообразованиями обращаются в медицинские учреждения при распространенном процессе, а общепринятые методы лечения недостаточно эффективны, в структуре смертности населения Белоруссии и России онкологические заболевания продолжают занимать второе место после сердечно-сосудистых. Это обусловливает актуальность разработки новых и совершенствование существующих методов диагностики и лечения рака молочной железы.
За последние 15 лет достигнуты успехи в исследовании иммунологии и иммунотерапии рака, в том числе рака молочной железы. Получены данные о том, что опухоли молочной железы развиваются на основе выраженных нарушений иммунной системы, возникающих уже при предопухолевых заболеваниях, определяются распространенностью опухолевого процесса и усугубляются применяемым лечебным воздействием (операцией, облучением, химиотерапией, гормонотерапией).
1. Факторы, способствующие возникновению рака молочной железы
Из множества разнообразных факторов риска при раке молочной железы можно выделить основные:
1. Возраст. Особенно внимательны должны быть к себе женщины старше сорока лет, так как рак молочной железы чаще выявляется в возрасте от 40 до 60 лет (около 50% всех случаев).
2. Наследственность. При наличии рака молочной железы у близких родственников (особенно в молодом возрасте) риск выявления у нее опухоли в 2,5 — 5 раз выше (в зависимости от степени родства). Однако, лишь около 5 % рака молочной железы передается из поколения в поколение, остальным только предрасположенность. В настоящее время найден ген рака молочной железы в длинном плече 17 хромосомы (BRCA-1) и ген предрасположенности в длинном плече 13 хромосомы (BRCA-2). Возможно, в будущем мы сможем использовать это в клинической практике.
3. Физические травмы молочной железы. Процент «посттравматического» рака молочной железы колеблется от 4,2 до 44,6.
4. Психические травмы (стрессы, частые волнения и переживания). Длительные перераздражения центральной нервной системы различными факторами приводят к ее функциональному истощению и тем самым нарушают нормальный обмен в организме, что предрасполагает к развитию злокачественных новообразований.
5. Питание. Избыточное потребление животных жиров, высоко-калорийной пищи, недостаток витаминов (особенно А, Е, С), ожирение.
6. Детородная функция женщины. Сюда можно отнести раннее, до 12 лет, начало менструаций и поздний климакс (после 53-55 лет), поздние первые роды (в 26 лет и старше) и вообще роды после 40 лет, малое число родов, кратковременность кормления грудью, частые аборты, воспаление придатков матки, пониженная половая возбудимость (фригидность), первичное бесплодие, нерегулярность и позднее начало половой жизни, перенесенные маститы и др.
7. Нарушение функции печени, щитовидной железы, яичников.
8. Плохое качество воды и воздуха.
9. Повышенная ионизирующая радиация. При изучении случаев заболевания после атомной бомбардировки в Японии оказалось, что частота опухолей молочной железы значительно выше у подвергшихся атомной бомбардировке. Наиболее сильное действие радиации проявилось у тех, кто подвергся ей в возрасте 10 — 19 лет, слабее ?- у женщин старше 35 лет. Кроме того, были оценены также результаты обследования женщин по медпоказаниям (например, рентгеноскопии грудной клетки при туберкулезе, радиотерапия при мастите, анкилозирующем спондилите, сколиозе и т.д.). Было показано, что ионизирующая радиация на грудную клетку в умеренно высоких дозах (например, между 1 и 3 Гр) до 40 лет повышает риск рака молочной железы, и дальнейшее повышение дозы увеличивает этот риск. Частое наблюдение рака молочной железы наблюдали также после радиотерапии по поводу болезни Ходжкина (лимфогрануломатоза). Вторичный рак молочной железы наблюдается после радиотерапии первичного рака, но только среди женщин, облученных в возрасте до 45 лет[11,19].
Сравнительно мало исследований о влиянии малых доз радиации на риск появления рака молочной железы. Повышение этого риска было отмечено у живописцев, работающих с радиоактивными красками при покрытии ими циферблатов часов и получающих недельную дозу 0,001 — 0,004 Гр, а также у медиков-радиологов. Общие диагностические процедуры, такие как рентгенография грудной клетки и маммография, дают на ткани молочной железы радиацию 0,0002 и 0,00015 Гр соответственно. Менее 1 % рака молочной железы можно отнести к результату от общих диагностических процедур (радиологических). Поэтому большинству женщин делают маммографию после 40 лет, когда риск рака молочной железы от этого облучения очень малый[19].
Что касается Чернобыльской аварии, то в 1995 г. отмечен более высокий темп роста рака молочной железы в Гомельской области.
10. Витамин Д. При изучении женщин с севера и юга было обнаружено, что, возможно, витамин Д и его метаболиты могут снижать риск рака молочной железы. Однако исследования продолжаются.
В настоящее время окончательно не установлены причины и сам механизм развития РМЖ, следовательно, полная и гарантированная профилактика РМЖ не может быть осуществлена. Вместе с тем, в результате многочисленных экспериментальных и эпидемиологических исследований выявлен ряд факторов, повышающих риск возникновения опухолей молочной железы.
Все многообразие факторов риска РМЖ можно отнести к трем основным группам [1—3].
1. Факторы, характеризующие функционирование репродуктивной (воспроизводящей) системы организма женщины — менструальная, половая, детородная, лактационная функция, а также сопутствующие заболевания женской половой сферы, оказывающие влияние и тесно связанные с функцией данной системы.
Менструальная функция. При сравнении среднего возраста наступления месячных у больных раком молочной железы и здоровых эпидемиологи отметили, что для больных характерно более раннее их наступление. Относительный риск заболеть РМЖ для женщин, у которых менструации наступили раньше 12 лет, в 2 раза выше, чем для женщин с началом месячных в 16 лет и старше.
Известно, что риск возникновения РМЖ при наступлении менопаузы после 55 лет в 2—2,5 раза выше, чем при менопаузе до 45 лет. У женщин с удаленными по разным причинам яичниками в возрасте до 40 лет наблюдается снижение риска возникновения РМЖ на 47 % по сравнению с контингентом женщин с естественной менопаузой в 45 — 54 года.
Детородная функция. Наибольшее значение имеет не столько число беременностей и родов, сколько возраст женщин в период беременности, закончившейся родами. Известный американский эпидемиолог Макмэхн приводит статистические доказательства, что у рожавших ранее 18 лет риск развития РМЖ втрое меньше, чем у впервые рожавших после 35 лет. Почти 15 -кратное увеличение этой заболеваемости у американок, рожавших впервые после 35 лет, по сравнению с японками, рожавшими ранее 18 лет, объясняется неблагоприятными гормональными изменениями при поздней первой беременности.
Риск развития РМЖ повышается при наличии в анамнезе у женщин как самопроизвольных, так и искусственных абортов, особенно до первых родов.
Гинекологические заболевания. К факторам, способствующим нарушению нейроэндокринного статуса организма и повышающим риск развития РМЖ, относят некоторые заболевания женской половой сферы — хроническое воспаление придатков, кисты яичников, фибромиому матки, эндометриозы.
2. Генетические факторы — наличие злокачественных опухолей, главным образом молочной железы, по линии отца и матери.
Эпидемиологами подсчитано, что среди женщин, родственники которых болели РМЖ, риск развития рака увеличивается в 2 — 3 раза по сравнению с женщинами, не имеющими такой наследственности. Риск увеличивается в 8 раз при наличии РМЖ у родной сестры. Различают «семейный» и «наследственный» РМЖ. «Семейный» рак представляет собой скопление больных опухолями молочной железы в пределах одной семьи и обусловлен влиянием генетических факторов и развивается в возрасте до 50 лет. Они также могут быть подвержены, большому риску заболеть раком яичников.
Расчеты, проведенные экспертами ВОЗ в Канаде, показали, что приблизительно 25 % случаев РМЖ связаны с поздним возрастом первых родов, 10 — 20 % случаев рака связано с «семейным анамнезом», то есть с наличием РМЖ у близких родственников, 27 % случаев — с высоким содержанием жира в диете, 13 % случаев — с превышением массы тела. У остальных больных РМЖ имеется различная патология гениталий.
3. Предшествующие и сопутствующие заболевания — патологические процессы, связанные с изменением эндокринно-обменного фонда организма [10,11].
2. Методы диагностики рака молочной железы
Для диагностики рака молочной железы используются следующие методы:
1. Опрос и физикальное обследование.
1.1 Сбор и оценка жалоб, анамнеза жизни и анамнеза заболевания.
1.3 Пальпация молочной железы и регионарных лимфоузлов.
2. Специальные методы исследования.
2.1 Рентгенологические методы (маммография, дуктография).
2.2 Другие методы визуализации (узи, термография, диафаноскопия).
3.2 Биохимический анализ крови.
3.3 Цитологическое исследование.
3.4 Патогистологическое исследование.
В настоящее время все большую актуальность приобретают лабораторные методы диагностики. С помощью цитологических и патогистологических методов можно не только подтвердить диагноз рака молочной железы, но и выяснить структуру, форму опухоли, определить степень дифференцировки атипичных клеток. Ниже будут рассмотрены цитологические и патогистологические методы диагностики РМЖ.
3. Цитологическая патолоанатомическая дагности-ка рака молочной железы
Наибольшую ценность в диагностике заболеваний молочной железы имеют морфологические методы исследования. К ним относятся цитологическое изучение выделений из соска, цитологическое исследование материала, полученного при пункционной биопсии (тонкой иглой) опухоли. Гистологическое исследование столбика ткани из опухоли, взятого специальной иглой (трепанобиопсия). В сомнительных случаях прибегают к эксцизионной биопсии — производится секторальная резекция молочной железы и вся опухоль посылается на исследование. При диффузном поражении молочной железы и возникшем подозрении на рак можно иссечь часть уплотнения для срочного гистологического исследования (инцизионная биопсия). Нужно иметь в виду, что последние два вида биопсии выполняются при условии возможности выполнения радикальной способность метода операции, если будет выявлен рак.
Пункция молочной железы проводится с целью получения материала для цитологического исследования. Ее выполняют обычной иглой, получая в пунктате разрозненные клетки, или специальными иглами, позволяющими иссечь небольшой столбик ткани и выполнить гистологическое исследование. В этом случае метод называется пункционной биопсией. При установленном диагнозе рака молочной железы пункция проводится для выявления структуры опухоли.
3.1 Техника пункции молочной железы
Заранее готовят стерильный сухой пяти- или десятиграммовый шприц, иглы и предметные стекла. Шприц должен быть хорошо притерт. Иглы должны иметь диаметр 0.7 — 0.8 мм, длину 5 — 6 см. для пункции поверхностных образований и 6 — 9 см. для пункции образований, расположенных в глубине молочной железы. Предметные стекла обезжиривают спиртом. Больную укладывают на кушетку. Кожу дважды обрабатывают спиртом. Опухоль фиксируют пальцами левой руки. Резким движением прокалывают кожу и опухоль. После прокола следует убедиться, что из иглы не вытекает кровь. После этого производят несколько оборотов иглы вокруг оси, надевают шприц на иглу и пытаются втянуть в иглу содержимое. Перед тем, как извлечь иглу, шприц с нее снимают.
Заключительным этапом диагностики рака молочной железы является секторальная резекция. Вмешательство выполняют под местной анестезией 0.25% раствора новокаина. Двумя полу окружными разрезами в радиальном направлении окаймляют опухоль, отступя на 2 см. от ее краев. Один из разрезов углубляют до фасции большой грудной мышцы и отслаивают от нее пораженный сектор. В образовавшееся пространство вводят четыре пальца левой руки и приподнимают удаляемый участок. После этого в пределах здоровых тканей углубляют разрез с противоположной стороны и удаляют иссеченный участок.
3.2 Основные этапы макроскопического исследования материала, удаленного в ходе операции на молочной железе
Врач, начиная осмотр доставленного материала, внимательно читает бланк направления, и еще раз проверяет соответствие фактического материала и информации о нем в направлении. Затем, осматривая материал, подробно описывает его внешний вид грамотным медицинским языком. При описании должны быть обязательно отражены: внешний вид, размеры, консистенция и вид на разрезе данного материала (при необходимости, вес).
Вырезать и давать заключение по этому материалу должно одно и то же лицо, соблюдая общие правила, а именно:
— нельзя разрезать удаленный орган с патологическим процессом или только патологический процесс пополам, затем еще на две части и т.д., разрез нужно делать так, чтобы хотя бы в одном месте сохранить естественные связи тканей;
— если патологический очаг крупный, то не следует ограничиваться двумя разрезами, а разложить ткань на серию пластин, толщина которых должна соответствовать толщине кусочка направляемого в заливку;
— вырезают кусочки не только из центра патологического очага, но обязательно на границе с неизмененными тканями и из других участков, чтобы установить характер фоновых процессов.
Если диагноз перед операцией морфологически не верифицирован, при оперативных вмешательствах на молочной железе обязательно проводится взятие интраоперационной биопсии для срочного гистологического исследования, целесообразно параллельное цитологическое исследование отпечатков или мазков из соскоба с поверхности разреза. В соответствии с результатами этих исследований строится тактика оперирующих хирургов, определяется объем операции.
Вырезку материала необходимо проводить в резиновых перчатках с обязательной пальпацией присланных тканей и, используя лупу. Участки после секторальной резекции рассекаются параллельными разрезами перпендикулярно к коже. При наличии узлов или кист вырезается по 1 кусочку из каждого узла или стенки кисты, обязательно забираются участки ткани с «мраморным» рисунком или матово-серого цвета хрящевидной консистенции, участки серебристо-серого цвета. При выявлении на срочной биопсии участков пролиферации эпителия протоков вырезается не менее 7 кусочков из разных мест. Кусочки после срочного исследования обязательно пускаются для контроля в парафиновую проводку.
Удаленная железа с опухолью, жировой клетчаткой подмышечной области и мышечной тканью сначала освобождается от грудных мышц. Затем, после осмотра соска, производят серию параллельных разрезов перпендикулярно коже, оставляя ее неповрежденной. При локализации опухоли в области соска, его рассекают вместе с крупными протоками и прилежащими участками кожи. Если ранее была произведена секторальная резекция, то особенно тщательно осматривается послеоперационное поле с окружающими тканями. Кроме обычных 1 — 2 кусочков из опухоли и границы процесса, вырезается по 1 кусочку кожи, соска, крупных протоков в случае вовлечения их в опухолевый процесс; все лимфатические узлы с обязательной маркировкой их по лимфатическим коллекторам. Если проводилась расширенная мастэктомия с удалением ребер и части грудины, нужно исследовать лимфоузлы каждого межреберья, потому что в них нередко находят метастазы, в то время как подмышечные и подключичные узлы не поражены.
3.3 Цитологические формы рака молочной железы
Выделяют три цитологические формы мелкоклеточную, среднеклеточную, крупноклеточную. К мелкоклеточным относятся раковые опухоли, размеры клеточных элементов варьируют в пределах 9 — 26 мкм. Форма клеток приближается к кубической, цилиндрической, округлой. Ядра в большинстве округлые, реже овальные. Размеры их колеблются от 5 до 7мкм.
Средний размер клеток среднеклеточого рака колеблется от 7.2 до 28.6 мкм. Форма клеток округлая, овальная, вытянутая, нередко отросчатая. Размеры ядер значительно колеблются (от 0.72 до 7.29 мкм). Встречаются многоядерные клетки.
К крупноклеточным отнесены опухоли, средние размеры клеток которых колеблются от 11.7 до 28.6 мкм. В этой группе выражены полиморфизм и неодинаковые размеры как самих клеток, так и основных элементов их. Во многих клетках цитоплазма вакуолизирована. Встречаются многоядерные и гигантские клетки, голые ядра. Имеются клетки в состоянии жировой дистрофии, некробиоза, некроза.
Мелкоклеточный рак наблюдается преимущественно при дифференцированных формах (железистый, сосочковый, криброзный), среднеклеточный при фиброзном и солидном раке, крупноклеточный — чаще всего при внутрипротоковом, медуллярном, плоскоклеточном раке.
В суспензии пунктатов и соскобов, а также в мазках клетки бывают различной формы: округлые, овальные, бобовидные, булавовидные, отростчатые, удлиненные. Часть клеток малых и средних размеров по форме близка к цилиндрическому и кубическому эпителию. В препаратах выделений из соска клетки в основном круглые, расположены разрозненно и в небольших сосочкоподобных комплексах. Отмечаются признаки дистрофических изменений цитоплазмы, более интенсивная окраска ядер и цитоплазмы по сравнению с препаратами пунктатов и соскобов.
Многоядерные клетки, содержащие по 3 — 5 ядер, наиболее часто наблюдаются при средне- и крупноклеточной формах рака. Большое количество ядер в одной клетке придает ей вид тутовой ягоды. Располагаются ядра в основном эксцентрично.
Митозы чаще всего наблюдаются в клетках средних размеров. В опухолях с выраженной митотической активностью митозы обнаруживаются в 1-2 клетках на 5 — 6 полей зрения окрашенного мазка.
Цитоплазма раковых клеток кажется слабо развитой по сравнению с увеличенными ядрами. В цитоплазме часто содержится крупная и мелкая зернистость, вакуоли. В ряде клеток слизистого рака выявляются вакуоли, выполненные слизью.
Сосочково-железистая форма рака в гистологических препаратах характеризуется сосочковыми и железистыми структурами, выстланными атипическими клетками кубического и цилиндрического эпителия.
В срезе солидного рака отмечаются округлые, овальные, трубчатые образования, напоминающие железы, но не имеющие просветов. Эпителий атипичен, частично сохраняет форму цилиндрического. В цитологических препаратах много альвеолоподобных, шарообразных, овальных и трубчатых структур. В таких структурах клетки расположены в 4 — 10 слоев. Клетки резко анаплазированы.
Медуллярный рак. Обширные поля атипических эпителиальных клеток. Строма развита слабо. В цитологическом препарате суспензии определяются пласты и отдельно расположенные, преимущественно большие клетки с умеренно развитой цитоплазмой. В мазках хорошо выраженная атипия, полиморфизм клеток.
Внутрипротоковый (угревидный) рак. В срезе расширенные протоки выполнены атипическим эпителием, детритом. Атипические клетки центральных участков, расположенные ближе к просвету, обычно больших размеров, с хорошо развитой цитоплазмой. Клетки, размещенные на мембранах, ориентированы радиально и напоминают цилиндрический эпителий. В цитологическом препарате суспензии определены пласты клеток, в которых иногда можно наблюдать остатки бывшей округлой структуры, где периферически расположенные клетки несколько напоминают цилиндрический эпителий. Клетки центральной части более крупные, созревающие, с признаками дистрофии; много разрозненных, деформированных и вакуолизированных клеток, особенно хорошо заметных в окрашенных мазках.
Фиброзный рак. В срезе видна хорошо развитая соединительная ткань, инфильтрированная атипическими эпителиальными клетками. Растущий эпителий раковой опухоли сдавлен, расположен вертикально по отношению к волокнам, по 1 — 4 клетки, иногда отдалённо напоминает цилиндрический эпителий, формирует тяжи, небольшие группы и железистоподобные структуры. В суспензии цитологического препарата определяются разрозненные полиморфные клетки.
Слизистый рак. На срезе среди фиброзной ткани, местами разделённой на пучки и отдельные волокна скопившейся слизью, видны тяжи, комплексы и небольшие поля крупных атипических эпителиальных клеток. В цитоплазме наблюдаются различных размеров вакуоли со слизью.
В цитологических препаратах обнаруживаются располагающиеся группами, комплексами и разрозненно крупные полиморфные эпителиальные клетки с хорошо развитой цитоплазмой. В ней хорошо заметны в фазовоконтрастном микроскопе различных размеров вакуоли, а в окрашенных мазках — пустоты. Размеры клеток и ядер колеблются. Ядра в основном округлые, овальные, в клетках с вакуолями — полулунные. Ядрышки увеличены, по 2 — 3 в ядре.
Плоскоклеточный неороговевающий рак. На срезе определяются обширные поля, разделенные узкими прослойками фиброзной ткани и состоящие из атипических, преимущественно полигональной формы, крупных плоских клеток с большими округлыми ядрами. По краю препарата очаги некроза, круглоклеточный воспалительный инфильтрат.
В цитологических препаратах разрозненно и пластами расположены крупные атипические, полиморфные, полигональные, плоскоэпителиальные клетки с плотной цитоплазмой, богатой мелкой зернистостью .Ядра преимущественно округлые с грубопетлистой сетью хроматина. Ядрышки большие. Во многих клетках имеются признаки дистрофии, некробиоза, выявляется мелкозернистый детрит, лейкоциты, лимфоциты.
Рак Педжета. На срезе структура многослойного плоского эпителия нарушена, форма клеток изменена. Клетки базального, шиповатого и зернистого слоев имеют укрупненные ядра и ядрышки, в цитоплазме многих из клеточных элементов заметны вакуоли. Узкие тяжи атипических клеток базального слоя врастают в подлежащую воспалительно измененную ткань. На многих участках роговой слой покрова не наблюдается.
В цитологических препаратах наряду с клетками многослойного плоского эпителия с увеличенными ядрами видны разрозненные и небольшие пласты атипических клеток плоскоэпителиальной природы полигональной, овальной, удлиненной, треугольной формы. Цитоплазма клеток умеренно развита, содержит мелкую зернистость. Хроматин ядер в основном мелкозернистый. Ядрышки большие. В препаратах отмечаются небольшие группы и тяжи клеток средних размеров и мелких со слабо развитой цитоплазмой и нежнопетлистой структурой хроматина ядер — атипические клетки базальные слоев эпителия, обладающие способностью к инвазивному росту. В препаратах обнаруживаются также мелкозернистый детрит в небольшом количестве, лейкоциты, лимфоциты.
Из элементов стромы раковых опухолей в цитологических препаратах содержатся в очень небольшом количестве фиброциты фибробласты, эндотелии, иногда обрывки капилляров. Часто выявляются тучные клетки, лимфоциты, лейкоциты, плазматические, эритроциты, тканевой детрит [10].
3.4 Гистологическая характеристика рака молочной железы. гистологическая классификация эпителиальных опухолей молочной железы
а. Инфильтрирующий протоковый рак
б. Инфильтрирующий протоковый рак с преобладанием внутрипротокового компонента
в. Инфильтрирующий дольковый рак
и. Секреторный (ювенильный) рак
II. веретеноклеточного типа
III. хондроидного и остеоидного типа
Неинфильтрирующий протоковый и дольковый рак.
Внутрипротоковый рак составляет не более 2 % от других форм. Характеризуется четырьмя основными типами роста: солидным, угревидным, папиллярным, криброзным. Чаще в одной опухоли встречаются все варианты роста, но иногда один из них превалирует. Характерную микроскопическую картину имеет угревидный рак: ткань молочной железы в области поражения пронизана желтовато-серыми тяжами, образованными расширенными протоками, из которых на разрезе выдавливается в виде пробок крошковидная масса. Иногда это нечетко ограниченные сероватого цвета узлы с зернистой поверхностью. Микроскопически обнаруживаются солидные внутрипротоковые пролифераты массивным некрозом в центре, некротические массы нередко кальцифицированы. Клетки полиморфные с гиперхромными ядрами и многочисленными фигурами митоза. Иногда определяются клетки с признаками апокринизации.
Наряду с угревидными встречаются расширенные протоки с криброзными структурами, образованными достаточно однотипными клетками средних размеров, иногда более крупными клетками с обильной эозинофильной цитоплазмой. В отличие от протоковой гиперплазии при раке в криброзных участках просветы четко очерчены, округлые. Митозы немногочисленны.
Опухоль может быть представлена только сосочковыми структурами. Иногда это маленькие сосочки из довольно мелких умеренно полиморфных клеток, с явлениями некроза по поверхности сосочков. Иногда определяются структуры, напоминающие внутрипротоковые папилломы, однако они построены только из эпителия, не имеют соединительнотканной ножки, а образующие их клетки достаточно однотипны в отличие от двухслойной выстилки в папилломах. В этом случае наиболее достоверным признаком злокачественного роста является инвазия в основание сосочков или в стенку кисты, если разрастания располагаются внутрикистозно. Также могут наблюдаться очаги кальцификации. Этот признак служит основой для рентгенологического распознавания опухоли. Однако очаги кальцификации выявляются также при аденозе, в частности, склерозирующем аденозе, в других структурах при фиброзно-кистозной мастопатии.
Для внутрипротокового рака характерно внутриэпителиальное распространение в пределах долек — канцеризация долек. При этом архитектоника долек сохраняется, но образующие их структуры образованы полиморфным эпителием. Иногда в пределах долек формируются железистоподобные структуры. В отличие от долькового рака при канцеризации долек клетки обладают более выраженным полиморфизмом, часто видны очаги некроза. Отмечается, что необнаружение инвазии в препаратах при внутрипротоковом раке не означает отсутствие ее в других отделах молочной железы. Исследование молочной железы за пределами удаленной при секторальной резекции ткани позволило выявить остатки внутрипротокового рака или участки инвазии. Вероятно, этим можно объяснить довольно частое (до 40%) развитие инфильтративного рака в той же молочной железе, в которой была проведена только секторальная резекция, спустя несколько лет, а также выявление регионарных и отдаленных метастазов.
Дольковый рак in situ (альвеолярный рак, ацинарный рак, неинфильтративный дольковый рак) наиболее часто встречается в возрасте 45 — 47 лет. Возникает мультицентрично, преимущественно в верхненаружном квадранте молочной железы. Иногда отмечается билатеральное поражение. Как правило, обнаруживается при микроскопическом исследовании молочной железы, удаленной по поводу доброкачественного новообразования, либо сочетается с другими формами рака. Дольки обычно образованы мономорфными округлыми или слабо связанными между собой клетками с нежным рисунком хроматина. Клетки обычно мелкие, реже встречаются более полиморфные крупные клетки с гиперхромными ядрами, в этих случаях чаще встречаются фигуры митоза. Хотя опухолевые клетки крупнее нормальных клеток молочной железы, их размеры меньше клеток протокового рака. В некоторых клетках обнаруживается слизь, встречаются перстневидные элементы. Для рака in situ характерно так называемое педжетоидное распространение по протокам. Клетки из альвеол проникают под эпителий протоков и постепенно его замещают, но они никогда не достигают крупных протоков и соска.
Инфильтрирующие формы рака.
Инфильтрирующий протоковый рак. В эту группу входят все раки, не относящиеся к какой-либо другой категории инвазивного рака- опухоли без специфических гистологических черт, раки с выраженным фиброзом стромы (скирр), солидные и солидно-железистые раки. Составляют эти опухоли более 80% среди других вариантов инвазивного РМЖ. Макроскопически вариабельны, но преобладают узлы звездчатой или овальной формы, плотной консистенции. Микроскопически опухоли представлены разнообразными структурами: трабекулярными, альвеолярными различного размера, железисто-сосочковыми, солидными, участками скирра, структурами, напоминающими карциноид. В данной категории рака возможно выделение степеней злокачественности или разделение их на высокодифференцированные и анаплозированные формы.
Инфильтрирующий протоковый рак с преобладанием внутрипротокового компонента. Инфильтративный рак, в котором структуры внутрипротокового компонента превышают инвазивный по крайней мере в 3 — 4 раза. Выделение этой формы обусловлено там фактом, что прослежена некоторая зависимость между агрессивностью протокового рака и относительным количеством неинвазивного и инвазивного компонентов. Формулируя заключение, в подобных случаях указывают виды структур и относительное соотношение указанных компонентов.
Дольковый инфильтрирующий рак является более поздней стадией развития долькового рака in situ. Иногда альвеолярные структуры рака увеличиваются в размерах, постепенно как бы сливаются между собой, образуя гигантские дольки, разделенные узкими прослойками соединительной ткани. Отмечается потеря органоидности, и предсуществовавшие дольки включаются в очаги инвазивного роста. Более характерным типом инвазии при этой форме является скиррозноподобный, когда опухолевые клетки лежат в виде цепочек, цугов или диффузно в довольно плотной строме. Нередко они располагаются концентрически вокруг протоков, образуя мишеневидные структуры. Встречаются также опухоли тубулярного или мелкоальвеолярного строения. Иногда клетки накапливают слизь и приобретают форму перстневидных. В распознавании долькового инвазивного рака существенным является смыкание остатков структур долькового рака.
Слизистый рак (синонимы: коллоидный рак, желатинозный рак, мукоид-ный рак, муцинозный рак, перстневидноклеточный рак). Макроскопически представляет собой довольно четко отграниченный узел серого цвета с влажной желатинозной поверхностью разреза. Микроскопически среди массивных скоплений слизи обнаруживаются солидные или железистоподобные комплексы довольно мономорфных клеток, содержащих в цитоплазме слизь. В части протоковых инфильтративных раков могут обнаруживаться скопления слизи, но термин «слизистый рак» следует использовать только в тех случаях, когда в опухоли преобладают поля внеклеточной слизи. Некоторые исследователи рассматривают перстневидноклеточный рак как разновидность слизистого рака, построенного по типу скирра, другие относят его к дольковому раку. Считается, что прогноз «чистого» слизистого рака благоприятнее, чем прогноз протокового инфильтративного.
Медуллярный рак. Макроскопически, как правило, имеет вид четко отграниченного узла сероватого цвета, рыхлой консистенции. Иногда в центре узла отмечается распад и образуется полость, что может имитировать картину внутрипротоковой папилломы. Микроскопически представлен полями из крупных клеток с пузырьковидным ядром, содержащим заметные ядрышки, резко полиморфнымы. Часто встречаются фигуры митоза, среди них как правило, выделяются атипические формы. Строма нежная, диффузно инфильтрирована лимфоидными и плазматическими клетками. Границы опухоли четкие, как бы отодвигающие окружающие ткани. Несмотря на резко выраженный полиморфизм клеток и высокую митотическую активность, прогноз при этих опухолях лучше, чем при инфильтрирующем протоковом раке.
Папиллярный рак является редкой формой, которую выделяют при превалировании сосочковых структур либо в случае имитации внутрипротоковых или впутрикистозных папиллом. Дифференциальный диагноз с последними бывает очень трудным. В пользу рака свидетельствуют инвазия в стенку протока, отчасти клеточность сосочков, тенденция к формированию криброзных структур, полиморфизм и гиперхроматоз ядер.
Тубулярный рак выделен из группы протокового инфильтративного рака в связи с более благоприятным клиническим течением. Представлен однослойными трубочками несколько угловатой, вытянутой формы, образованными мономорфными кубическими, реже циллиндрическкими клетками. Выделяют различные подгруппы тубулярного рака в зависимости от преобладания в опухоли тубулярных структур, их сочетания с мелкоальвеолярными комплексами. Последние располагаются по периферии узла в более рыхлой строме. Трубочки лежат в центре, в плотной гиалинизированной ткани. Тубулярный рак не следует путать с инфильтритивным протоковым раком железистоподобного строения, который построен из более полиморфных клеток.
Аденокистозиый рак редкая форма опухоли, напоминающая по строению цилиндрому или цистаденоидный рак слюнных желез. Выделяют ее в связи с более благоприятным прогнозом по сравнению с протоковым инфильтративным раком. Аденокистозный рак следует отличать неинвазивного внутрипротокового рака.
Секреторный (ювеиильнын) рак встречается преимущественно у молодых женщин. Представлен мелкоацинарными структурами секретирующих ШИК-положительное вещество клеток. Дифферренциальный диагноз необходимо проводить с протоковым раком беременных.
Апокринный рак (синонимы: онкоцитарный рак, рак потовых желёз). Образующие его структуры не отличается от протокового инфильтративнего рака. Представлен железистоподобными, иногда угревидными структурами из крупных резко полиморфных клеток с обильной эозинофильной мелкозернистой цитоплазмой и уродливыми ядрами.
Рак с метаплазией. В протоковых инфильтрирующих раках образуются участки метаплазии различного типа. В некоторых случаях обнаруживаются фокусы типичного плоскоклеточного рака с тенденцией к ороговению, в других случаях участки веретеноклеточного строения с фокусами хондроидной и/или остеоидной метаплазии. Нередко в наблюдениях отмечаются смешанные структуры. Во всех типах отмечается резко выраженный полиморфизм клеток, большое число патологических митозов [8].
3.5 Значение определения содержания стероидных гормонов, маркеров пролиферации, белков-супрессоров
Определение гормонального профиля, уровня рецепторов стероидных гормонов в опухоли позволяет определить гормоночувствительность опухоли и выработать оптимальную схему гормонотерапии.
Открытие специфических гормональных рецепторов эстрогенов (РЭ) в раковых опухолях молочной железы позволило подойти к пониманию механизма действия различных видов эндокринной терапии и использовать определение их уровня для выявления чувствительности опухоли к данному виду лечения. Первые же исследования показали, что при наличии определенной концентрации РЭ в опухоли на эндокринную терапию отвечают 55 — 60 % больных, тогда как при отсутствии РЭ — лишь 5 — 8 %.
После открытия рецепторов были получены данные об их структуре, свойствах, взаимосвязи с другими признаками опухолевого роста.
Рецепторы стероидных гормонов — критерий чувствительно-эндокринной терапии. Одними из первых клеточных маркёров были рецепторы эстрогенов (РЭ) в опухолях молочной железы. Несколько позднее стали определять также рецепторы прогестерона (РП). Рецепторы стероидных гормонов — это белки, специфически и избирательно связывающие соответствующие пептиды после их проникновения в клетку и опосредующие таким образом их биологические эффекты.
У 50 — 70 % больных, у которых в опухолях содержались РЭ, отмечена объективная ремиссия после эндокринной терапии. Несмотря на это, не обнаруживается полная корреляция между присутствием рецепторов гормонов и ответом опухоли на эндокринную терапию. Известно, что 30 — 35 % больных с рецепторположительными опухолями не реагирует на лечение. В то время у 5 — 8 % больных с рецептороотрицательными опухолями обнаруживается чувствительность к соответствующей гормонотерапии.
Различные виды лечения (лучевое, химиотерапия) могут влиять на рецепторный состав опухоли. С этих позиций представляется важным исследование зависимости рецепторного состава опухоли от концентрации в крови некоторых эндогенных гормонов и гистологической структуры опухоли, а также изучение влияния различных видов терапии на уровень рецепторов стероидных гормонов.
Состояние эндокринной системы у больных раком молочной железы является важным фактором при выборе метода лечения. С целью комплексной оценки характера гормонального дисбаланса проводят радиоиммунологические исследования. В плазме крови определяют концентрацию пептидных гормонов гипофиза: фолликулостимулирующего гормона, лютеотропного гормона, пролактина и половых стероидных гормонов — 17-эстрадиола, тестостерона.
Пролиферативная активность является ведущим фактором, как в механизме злокачественной трансформации клеток, так и в биологическом поведении уже возникших опухолей. Многие из рассмотренных выше факторов свое патогенетическое действие на опухоль опосредуют через изменение пролиферативной активности ее клеток. В последнее время разработаны новые высокоинформативные методические подходы для определения особенностей пролиферации клеток злокачественных опухолей человека.
Очень перспективным маркером пролиферации является антиген КI-67, экспрессирующийся практически во всех фазах митотического цикла и, соответственно, отражающий величину пролиферативного пула. Иммуногистохимические реакции на выявление пролиферативных маркеров характеризуются четким окрашиванием клеточных ядер. С точки зрения А.В.Упорова с соавторами, он является оптимальным пролиферативным маркером для широкого использования в патологоанатомической практике.
Пролиферативная активность РМЖ прямо коррелирует со степенью гистологической злокачественности, размерами опухоли, наличием метастазов в подмышечных лимфатических узлах и имеет обратные взаимоотношения с РЭ и РП. Пролиферативный индекс служит независимым прогностическим показателем возникновения рецидива, общей и безрецидивной выживаемости, а также предсказательным фактором для определения чувствительности к химио — и лучевой терапии. Так, например, при индексе КI-67 меньше 20 % 10-летняя выживаемость больных РМЖ была 80 %, а если он превышал 20 %, она снижалась до 52 %.
Кроме того, с использованием различных маркеров проведено огромное количество исследований, посвященных изучению пролиферации самых разнообразных типов опухолей органов и тканей. Практически во всех из них сделаны такие же выводы, как и в отношении РМЖ: индекс пролиферации является независимым прогностическим признаком, определяющим вероятность возникновения рецидива, общую и безрецидивную выживаемость.
Р53 является опухолевым геном-супрессором и его мутация очень часто встречается в опухолях. Иммуногистохимически экспрессия мутированного гена-супрессора выражается в отчетливом ядерном окрашивании. Проведено большое количество работ по иммуногистохимическому изучению повреждений р53 при РМЖ, в котором он выявляется в более чем 50% наблюдений. Преобладающее большинство исследований показало очень сильное взаимоотношение между ненормальным р53-фенотипом и плохим клиническим исходом: если опухоли были р53-позитивны, то рецидивы наблюдались почти у 60% больных, а при р53-негативных — только в 20% случаев. С другой стороны, больным с наличием регионарных метастазов назначали адьювантную терапию, которая была более успешной при отсутствии мутированного р53.
В работах последних лет высказывается предположение о том, что р53-статус может быть решающим фактором, определяющим чувствительность опухоли к химио- и лучевой терапии. Подтверждением этого предположения служат многочисленные исследования, доказывающие, что мутированный р53 является фактором плохого прогноза и неэффективности адьювантной терапии при самых разнообразных новообразованиях — раке пищевода, желудка, толстой кишки, легкого, мочевого пузыря, предстательной железы, надпочечников и др. [1,9,13,16 ].
источник