Меню Рубрики

Сигнальные пути рака молочной железы

Кандидат биологических наук А. ЛУШНИКОВА, кандидат медицинских наук Л. ЛЮБЧЕНКО, ГУ Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина РАМН.

Рак молочной железы — наиболее распространенный вид опухолей среди женского населения Европы, Америки и некоторых стран Азии. Ежегодно в мире регистрируется более одного миллиона случаев этого заболевания, а при средней продолжительности жизни 80 лет риск заболеть раком молочной железы составляет 12,5%. В течение последних 20 лет в мире, а также в России наметилась устойчивая тенденция к росту заболеваемости этим видом рака, особенно в городах и мегаполисах. С 1985 года он занимает первое место среди онкологических заболеваний у женщин, составляя 31,2%. Хорошо известно, что ежегодный профилактический осмотр способствует раннему выявлению опухолей. Однако часто пациентки обращаются к врачу уже с явными признаками опухоли, а это затрудняет последующее лечение. Одна из причин — непонимание важности ранней диагностики заболевания. Сейчас ученые глубоко проникли в механизмы возникновения раковой клетки, хотя многое до сих пор неясно. Как и другие онкологические заболевания, рак молочной железы по-прежнему остается коварным и агрессивным. Поэтому любому человеку очень важно иметь представление о развитии этого заболевания: предупрежден, значит, вооружен. Откуда такая напасть?

Вряд ли найдется однозначный ответ на этот вполне законный вопрос. Рак молочных желез известен с незапамятных времен: его случаи описаны, например, в древнеегипетских папирусах врача Имхотепа (3000 лет до н.э.), в вавилонском врачебном кодексе Хаммурапи (2250 лет до н.э.); о нем неоднократ но упоминает Гиппократ (400 лет до н.э.), а Гален (130-200 гг.н.э.) называет опухоли молочной железы раком из-за их внешнего сходства с крабом (по-гречески слова «краб» и «рак» звучат одинаково: karkinos). В отличие от множества заболеваний, причины которых выяснены, в основе развития злокачественных опухолей лежат более сложные механизмы и целый ряд причин, включая генетические особенности, факторы окружающей среды и многие другие.

Опухоли молочной железы могут быть как доброкачественными, так и злокачественными, или раковыми. Последние встречаются гораздо реже. Злокачественные опухоли возникают случайно или связаны с наследственностью. В 10% случаев заболевание передается из поколения в поколение и обусловлено врожденными мутациями в генах предрасположенности BRCA1 или BRCA2 (от англ. BReast CАncer).

Наиболее распространенное доброкачественное заболевание молочных желез — различные мастопатии, которые относятся к большой группе дисгормональных гипер-плазий (разрастания ткани молочных желез, обусловленные гормональными нарушениями) и связаны с нарушениями функций яичников, надпочечников, гипофиза, щитовидной железы или с нарушениями гормонального обмена в связи с заболеваниями печени, ожирением и т.д. Эти разрастания ткани молочных желез могут быть в виде плотных узелков, кист или диффузных образований. Некоторые из таких изменений можно отнести к предраковым.

И вот что удивительно, рак молочных желез встречается не только у женщин, но и у мужчин, но гораздо реже: с мужским населением связано около 1% всех случаев заболевания. Среди причин опухолей молочных желез у мужчин — редкие мутации в гене предрасположенности BRCA2, ожирение, гормональные нарушения. В отличие от доброкачественного разрастания ткани молочных желез злокачественное перерождение обязательно требует оперативного лечения.

Известно, что в отличие от нормальных клеток опухолевые не переходят после деления в фазу покоя, а продолжают бесконтрольно размножаться. Образование опухоли — многоступенчатый процесс. Рост и прогрессия опухоли, то есть ее переход от начальной к более агрессивной стадии, врастание опухоли в окружающие ткани, или инвазия, зависят от клеточных генов. Они контролируют клеточный цикл, межклеточные взаимодействия, старение и гибель клетки, а также отвечают за восстановление ДНК и стабильность клеточного генома.

Под действием различных факторов в нормальных генах могут возникать мутации. Чем дольше делятся клетки, тем вероятность таких мутаций выше, а значит, вероятнее злокачественное перерождение клеток под действием канцерогенов. Накопление повреждений в клеточном геноме связано как с ошибками репликации ДНК, так и с внешними, внеклеточными факторами.

К факторам риска на уровне человеческого организма можно отнести повышенный уровень эстрогенов (женских половых гормонов), нарушения менструального цикла, функций щитовидной железы и надпочечников, аборты и отсутствие грудного вскармливания. Эти особенности нередко встречаются в анамнезе больных раком молочной железы. К факторам, повышающим риск заболевания им, относятся также ранний возраст менархе (11-12 лет); поздние первые роды (28-30 лет); большие площадь и вес плаценты, усиливающие риск возникновения рака молочной железы у дочерей; аборты, особенно до первых родов; хроническое воспаление придатков; эндометриоз (разрастание клеток, выстилающих матку); кисты яичников и другие заболевания.

В возрасте после 65 лет наблюдается второй пик заболеваемости злокачественными опухолями молочной железы, связанный с эстрогенами надпочечников и повышенной массой тела. В общем разнообразные факторы риска этого заболевания можно условно разделить на три группы:

связанные с репродукцией (рождение детей/аборты, лактация, возраст менархе), сопутствующие гинекологические заболевания;

связанные с генетической предрасположенностью: злокачественные опухоли, особенно женских репродуктивных органов и молочных желез у близких родственников;

связанные с нарушениями обмена веществ и гормональными нарушениями, в том числе с приемом гормональных препаратов, содержащих эстрогены.

Развитию рака молочной железы предшествует разрастание ее ткани гиперплазия (увеличение числа клеток) и появление в протоках железы нетипичных клеток. Эти изменения называются предраковыми. К таковым относится и упомянутая нами мастопатия — кистозно-фиброзные и диффузные изменения ткани молочной железы. Хотя злокачественное перерождение при мастопатии происходит довольно редко, все же появление первых признаков мастопатии, выявляемых при пальпации, то есть осторожном прощупывании железы, — это повод для обращения к маммологу.

Маммография (рентгеновское обследование) и УЗИ — основные методы раннего выявления опухолей молочной железы и мастопатии. Результаты этих исследований нередко подтверждают ся с помощью пункции молочной железы, когда взятый иглой шприца образец предполагаемого новообразования исследуется под микроскопом. Очень часто изменения молочной железы обнаруживают сами пациентки при осмотре желез в первые 6-10 дней после начала менструаций.

Какие же признаки должны насторожить при самостоятельном обследовании? Во-первых, ощутимые уплотнения в молочной железе; изменение контура железы и ее плоская, а не округлая поверхность над уплотнением; отек железы, когда кожа напоминает пористую лимонную корку; втяжение соска внутрь. При запущенной злокачественной опухоли большая часть молочной железы отекает и краснеет, а при прорастании опухоли в кожу появляются язвы. Опухолевые клетки через лимфатические сосуды попадают в ближайшие лимфатические узлы, которые увеличиваются в размерах, нарушается отток жидкости из молочной железы, и развиваются отеки. Через кровеносные сосуды опухолевые клетки разносятся по организму и дают начало новым злокачественным очагам — метастазам.

Нередко предположение или заключение врача-маммолога о наличии патологических изменений в молочной железе порождает у пациенток самые неприятные опасения, а порой и панику. Однако на сегодняшний день уже имеется немало методов, позволяющих уточнить диагноз рака молочной железы и назначить соответствующее лечение, если диагноз подтвердится. Речь идет, прежде всего, о маркерах (факторах риска) опухолевого роста, обнаруживаемых в крови пациенток. Основное их предназначение — раннее выявление злокачественных новообразований и рецидивов, а также оценка эффективности лечения заболевания. При направлении в диспансер или специализированную клинику пациентке предложат сдать кровь на анализ таких маркеров. В отношении рака молочной железы пока не существует строго специфичного маркера, поэтому применяется комплекс тестов на несколько маркеров. Концентрации этих маркеров в сыворотке крови пациенток зависят от степени злокачественности и стадии заболевания и поэтому важны для диагноза и прогноза заболевания. Существуют и другие параметры, позволяющие специалисту заподозрить прогрессирование заболевания или метастатическое поражение других органов. Анализ этих показателей, в той или иной степени связанных с опухолями молочной железы, дает возможность спланировать дальнейшие действия: назначить химио- или гормональную терапию, хирургическое лечение либо лечебно-профилактические препараты в случае мастопатии или доброкачественных новообразований, к примеру фиброаденомы молочной железы. Перечень диагностических тестов меняется в зависимости от материальных возможностей клиники и пациенток, а также от конкретного случая заболевания.

Главное — своевременно и профессионально сделать анализы, руководствуясь рекомендация ми специалистов. В жизни, к сожалению, нередки случаи обращения пациенток к разного рода целителям и к так называемой народной медицине. Не умаляя значения фитотерапии и гомеопатии, врачи-онкологи настоятельно советуют обращаться именно в профильные учреждения: специализированные диспансеры и клиники, где пациентке помогут квалифицированные врачи. Промедление в выборе правильного метода терапии очень опасно.

В основу лечения рака молочной железы положен комбинированный комплексный подход в сочетании с хирургическим лечением. На опухоль воздействуют лекарственными препаратами, облучением, гормонами. Удаление всей молочной железы, или мастэктомию, зачастую заменяют компромиссным органосохраняющим лечением: удалением сегментов железы с подмышечными лимфатическими узлами. Сохранить и восстановить форму молочной железы позволяют реконструктивные операции, важность которых очевидна, особенно для молодых пациенток. Операбельны (подлежащие операции) обычно первая-вторая стадии рака. При запущенных опухолях или неоперабельном раке требуется дополнительное лечение, которое затормаживает рост опухоли и дает возможность хирургического вмешательства. Однако в большинстве случаев одного хирургического лечения недостаточно. Если риск рецидива низок, то есть опухоль мала (менее 1 см), отсутствуют метастазы в близлежащие и отдаленные лимфатические узлы, степень злокачественности низкая, а опухолевые клетки несут рецепторы опухолевых клеток к эстрогенам и прогестерону (главным половым гормонам женщины), то хирургическое лечение нередко дает устойчивый положительный эффект. Но иногда развиваются послеоперационные осложнения в виде кровотечений и нагноения раны. Вследствие удаления лимфатических узлов нарушается отток лимфы из тканей и развивается лимфостаз, обычно это происходит спустя несколько недель после операции. Нередко лимфостаз провоцируется инфекциями, горячими и солнечными ваннами, физическими нагрузками. Вот почему больным, перенесшим мастэктомию, не рекомендуются инъекции в руку на оперированной стороне, противопоказаны солярии и сауны, им нужно избегать инфицирования кожи через трещины или царапины. Полезны специальный массаж рук и гимнастика, улучшающие циркуляцию лимфы и восстанавливающие работу суставов.

Успех зависит от прогноза

Наиболее эффективное лечение опухолей молочной железы возможно лишь с учетом прогноза течения заболевания и реакции пациента на тот или иной препарат, то есть имеется ряд факторов, указывающих на благоприятный или неблагоприятный исход заболевания, а также на чувствительность опухоли к проводимому лечению. К таким факторам относятся размер опухоли, наличие метастазов в лимфатические узлы, гистология опухоли (ее строение, определяющее злокачественность), уровень эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в опухолевых клетках и другие.

Морфологические и молекулярно-биологические факторы прогноза рака молочной железы и эффективности лечения

Количество пораженных метастазами лимфатических узлов

Прорастание опухоли кровеносными и лимфатическими сосудами

Показатели активности синтеза ДНК

Плоидность опухолевых клеток

Интенсивность деления опухолевых клеток (уровень ядерного белка митозина, уровень ядерного антигена Ki-67 и т.д.)

Наличие рецепторов эстрогенов и прогестерона

Уровень активаторов и ингибиторов (блокаторов) плазминогена (белка, участвующего во многих клеточных взаимодействиях, в инвазии и метастазировании и др.).

Исследованию этих и других факторов посвящены многие монографии, мы отметим лишь принципиально важные для развития рака молочной железы у женщин. Во-первых, это рецепторы стероидных гормонов — специфические белки, которые избирательно связывают молекулы соответствующих стероидов, проникающих в клетки (рис. 2). Наличие в опухолевых клетках рецепторов к эстрогенам и прогестерону говорит о чувствительности опухоли к гормональной терапии и о малой возможности метастазирования. На чувствительность опухоли к лечению гормонами указывает также наличие в опухолевой ткани эпидермальных факторов роста (веществ, способствующих росту определенных типов клеток). Когда в опухолевых клетках нет рецепторов к стероидным гормонам, то лечить опухоли с помощью гормональной терапии бессмысленно.

В передаче сигналов к делению клеток участвует также рецептор HER2/neu (рис. 3). Его блокирование может замедлить или остановить деление опухолевых клеток и рост опухолей, которые зависят от этих сигналов. Для такой блокировки был разработан препарат герцептин. Когда ген, кодирующий этот рецептор, активно транскрибируется (переписывается), то целесообразно использовать химиотерапию с применением герцептина, а лечение гормонами в этом случае неэффективно.

Злокачественные опухоли способны к метастазированию и инвазии. В этих процессах главную роль играют белки uPA и PAI-1. Если их уровни превышают определенные минимальные значения, то риск рака молочной железы увеличивается в 1,5-2 раза, поэтому данные важны для прогноза.

Рост злокачественной опухоли сопровождается формированием в ней разветвленной сети капилляров — сравнительно мелких кровеносных сосудов. Процесс регулируется фактором роста эндотелия сосудов. Высокий уровень этого белка в опухоли свидетельствует о неблагоприятном прогнозе как при раннем, так и при прогрессирующем злокачественном процессе. Анализ активности фактора роста эпителия стимулировал создание новых препаратов, блокирующих рост злокачественных клеток, например перспективного препарата авастин.

В последнее время выяснилось, что в ткани молочной железы с помощью фермента ароматазы синтезируются собственные эстрогены. Поэтому подавление синтеза этого фермента с помощью препаратов, например аримедекса и аромазина, может снизить риск рака молочной железы. Таким образом, благодаря исследованиям биохимиков и молекулярных биологов в распоряжении врачей оказались биологически значимые параметры, позволяющие прогнозировать течение заболевания на различных стадиях и подбирать подходящую терапию при распространяющемся раке молочной железы. Во-первых, это уровни рецепторов к эстрогенам и прогестерону в опухоли, которые дают возможность оценить целесообразность гормональной терапии и предвидеть ее результат. Во-вторых, уровень активности гена Her2/neu (см. рис.3), позволяющий обнаружить пациенток с повышенным риском рецидива опухоли молочной железы и риском ее метастазирования на ранних стадиях заболевания. В-третьих, уровень фактора роста эпителия, указывающий на прогноз развития опухоли как в начале, так и на более поздних стадиях заболевания.

Читайте также:  Химиотерапия при рецидиве рака молочной железы

Молекулярно-биологическая подоплека рака молочной железы

Какие молекулярные механизмы лежат в основе рака? Известно, что развитие опухоли связано с нарушением роста и дифференцировки клеток и злокачественным их перерождением. Во многих случаях такие нарушения обусловлены мутациями или резким повышением активности клеточных онкогенов — нормальных генов, которые участвуют в регуляции клеточного цикла, передаче сигналов и в других процессах жизнедеятельности клеток. Сейчас известно немногим более 100 различных протоонкогенов — нормальных клеточных генов, повышенная активность изменения которых или изменение их структуры приводит к синтезу онкобелков, играющих ключевую роль в клеточной жизнедеятельности. Такая активация протоонкогенов и превращение их в онкогены возможны в результате мутаций, хромосомных перестроек и других механизмов. В клетке человека около 50 000 функционирующих генов, поэтому доля потенциальных онкогенов, ответственных за злокачественный рост клеток, достаточно велика. В случае рака молочной железы, вероятно, задействовано не более 10 онкогенов.

Кроме того, нарушения клеточного цикла и бесконтрольное размножение клеток могут быть связаны с мутациями в генах-супрессорах, или подавителях опухоли. К ним относятся, например, мутации в уже упомянутых нами генах BRCA1 и BRCA2. Эти гены кодируют высокомолекулярные ядерные белки, которые исправляют повреждения ДНК и поддерживают стабильность генома, а продукт гена BRCA1 участвует в правильном распределении хромосом при делении клеток, подавляет чрезмерное гормонозависимое размножение клеток молочной железы, которое происходит, например, при половом созревании и подготовке к лактации у беременных женщин. Вот почему мутации этого гена приводят к целому спектру нарушений, начиная от новых генных мутаций и хромосомных перестроек и кончая безудержным размножением клеток эстрогензависимых органов, определяю щим развитие опухолей молочной железы и яичников. Таким образом, мутации в генах BRCA1/BRCA2 нарушают контроль за повреждениями ДНК и поддержанием целостности клеточного генома, что обусловливает появление злокачественных клеточных клонов.

Помимо мутаций активность генов-супрессоров опухоли и других генов, ответственных за регуляцию, может изменяться в результате нарушений в молекуле ДНК. Это справедливо и по отношению к раку молочной железы.

В некоторых лабораториях с помощью специальных микрочипов исследуются профили изменений клеток опухолей молочной железы. Например, французские исследователи сравнили профили таких изменений в разных образцах злокачественных клеток до и после лечения препаратом доксорубицин, что позволило наметить и обосновать стратегию химиотерапии. Они выделили группу из 496 генов, активность (экспрессия) которых отличается от экспрессии этих генов в нормальной ткани молочной железы. Несколько лет назад были опубликованы результаты исследования экспрессии 200 генов, полученные на 122 образцах опухолевой ткани молочной железы. Выделили несколько групп генов рака молочной железы, начиная с экспрессии генов близкой к норме и кончая генами с экспрессией, дающей наихудший прогноз.

Во многих лабораториях проводятся эксперименты по созданию «молекулярного портрета» опухолей молочной железы. Японские исследователи, например, получили молекулярный профиль генов в процессе лечения пациенток препаратом доцетаксел. Оказалось, что чувствительные и устойчивые к этому препарату опухоли четко различаются по активности 76 генов.

Конечно, эти подходы пока очень трудоемки и дороги для применения на практике, однако они важны для разработки более специфичных и простых методов анализа эффективности лечения. Такие данные помогут в дальнейшем прогнозировать течение заболевания и чувствительность опухоли к терапии.

Возникновение рака может быть связано не только с нарушением работы онкогенов и других генов, но и с вирусными инфекциями.

В последние 10 лет появились веские доказательства того, что в организме человека циркулирует ретровирус, родственный вирусу опухолей молочных желез мышей, или MMTV (от англ. Mouse Mammary Tumor Virus). Их активация — сложная цепочка биохимических процессов, похожая на активацию некоторых ретровирусов, вызывающих лейкозы у человека и животных.

Сначала в сыворотках крови многих больных раком молочной железы обнаружили антитела к белкам, родственным структурным белкам оболочки MMTV. Затем в ДНК лимфоцитов периферической крови и в опухолевой ткани примерно у 40% больных спорадическим раком молочной железы с помощью высокочувствительных методов обнаружили последовательности, похожие по строению на гены этого ретровируса. Из генома опухолевых клеток, попадающих в плевральную полость больных раком молочной железы, были выделены и клонированы последовательности ДНК, на 95-97% соответствующие полноразмерному провирусу.

MMTV-родственный провирус человека, или hMTV (от англ. human Mammary Tumor Virus), был обнаружен в геноме лимфоцитов и опухолевых клеток, но не в нормальных тканях человека (рис. 4). Это указывает на внешний источник ретровирусной инфекции. Частота встречаемости MMTV-гомологичных последовательностей меняется от 0-1% (Великобритания) до 75-80% (Тунис). По нашим оценкам, в России она составляет от 39-42% при спорадическом раке молочной железы до 52-56% при семейном раке и у беременных женщин со злокачественной опухолью груди. Высказано несколько предположений о путях попадания вируса в организм человека, в том числе инфицирование через лимфоидную ткань желудочно-кишечного тракта из загрязненных мышиными фекалиями продуктов. Это предположение, по-видимому, небезосновательно, так как MMTV-гомологичные последовательности были выявлены в лимфоидной ткани больной раком молочной железы и раком толстой кишки, а провирусные последовательности обнаружены у домовых мышей Mus musculus sp.domesticus, обитающих в московском регионе. Более того, распределение MMTV-гомологичных последовательностей в человеческих популяциях соответствует распространению этого вида мышей. Не исключена передача MMTV человеку от мыши как непосредственно, так и через промежуточных «хозяев» (кошек, приматов).

Недавно группа исследователей из США под руководством доктора С. Росс показала, что первичной мишенью для ретровирусной инфекции могут быть древовидные клетки — определенные лимфоидные клетки, которые поглощают чужеродные белки и вирусные частицы путем пиноцитоза — процесса поглощения жидкостей и инородных тел (рис. 5). Оказалось, что эти клетки могут затем продуцировать инфекционный вирус и передавать его другим клеткам, в частности В- и Т-лимфоцитам. При отсутствии дендритных клеток эффективность инфекции MMTV резко ослабевает; несомненно, она зависит и от других причин. Для циркуляции в организме как мышей, так и человека MMTV использует лимфоциты периферической крови. На этом этапе число копий провируса в геноме сравнительно мало. Во время активного деления эпителиальных клеток молочной железы, растущей под действием гормонов, встроенный в клеточный геном провирус получает возможность быстрого умножения копий в тысячи раз. По-видимому, провирус может встраиваться в клетки молочной железы, обладающие свойствами стволовых клеток, которые впоследствии дают начало множественным очагам опухолевого роста. Есть данные о возможном прямом или опосредованном участии hMTV в развитии рака молочной железы. В экспериментах с культурами клеток рака молочной железы человека, содержащими (+) и не содержащими (-) провирусные последовательности, группа американских исследователей обнаружила, что в (+)-клетках наблюдается высокая активность генов, связанная с иммунным ответом на инфекцию. Кроме того, в этих (+)-клетках активировались восемь генов, которые были совершенно неактивны в (-)-клетках. Сравнение картин генной экспрессии с помощью микрочипов показало, что суммарная активность генов в инфицированных hMTV клетках соответствует активности генов при воспалительном процессе с участием интерферонов, то есть вирусная инфекция играет в развитии рака молочной железы вполне определенную роль.

Чем же отличаются инфицированные и не инфицированные hMTV опухоли? Ответить на этот вопрос попытались австралийские биологи. Они показали, что на ранних стадиях рака молочной железы у пациенток одной из клиник Сиднея инфицированные этим ретровирусом опухоли по своему строению и росту сходны с опухолями молочной железы у мышей. Однако определенное сходство в развитии рака молочной железы мышей и человека было замечено задолго до этой работы. И у человека и у мышей известны опухоли молочной железы, в которых очень быстрый рост начинается сразу в нескольких очагах. Есть основания предположить, что такие опухоли возникают из клеток типа стволовых, которые приобрели способность к злокачественному росту вследствие либо геномных нарушений в клетках, либо вирусной инфекции. Новым в исследовании австралийских ученых стал факт накопления в ядрах инфицированных hMTV опухолей молочной железы человека неактивного белка — продукта гена р53, подавляющего рост опухоли, о котором мы упоминали выше. Почему этот белок не работает, еще предстоит разобраться, но для таких опухолей характерен более быстрый рост, чаще всего они локализованы в области протоков молочных желез.

В то же время группа исследователей под руководством проффесора Сельмона из Австрии с помощью генно-инженерных конструкций показала, что продукт одного из генов МMTV содержит последовательность аминокислот, соответствующую последовательностям аминокислот в иммунорецепторах, или ITAM (от англ. Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs), участвующих в передаче сигналов, регулирующих развитие клеток. Гиперактивация этих сигнальных путей вследствие проявления провируса в эпителиальных клетках молочной железы может привести к перерождению клеток и развитию рака молочной железы. Возможность появления морфологически измененных клеток, способных к трехмерному росту в культуральной среде in vitro, проверена нами в экспериментах с клетками эпителия эмбриональной почки человека, которые культивировали с вирус-продуцирующими клетками мышей. Было показано, что вирусные последова тельности действительно встраиваются в клеточный геном и на них образуются транскрипты РНК. Внедрение провируса в геном клетки может повлечь изменение активности генов в области такого объединения. Кроме того, в геноме мышиного ретровируса имеются чувствительные к действию гормонов регуляторные элементы, которые также могут изменить или полностью нарушить работу клеточных генов. Вспомним также о кодируемых MMTV аминокислотных последовательностях в составе ITAM, которые могут опосредовать существенные изменения в инфицированных вирусом клетках. Однако при последующих делениях клеток в результате хромосомных перестроек некоторые из хромосом утрачиваются вместе со встроенными в клеточный геном копиями провируса. Таким образом, опухолевое перерождение вероятно лишь в ограниченном числе клеток. Другими словами, кроме горизонтальной передачи hMTV, по-видимому, существует и вертикальная: от матери к детям. При этом лимфоидная ткань кишечника человека может служить «воротами» ретровирусной инфекции, а лимфатические узлы — резервуаром. Важно, что при умножении числа провирусных копий в составе клеточного генома наблюдается минимальный иммунный ответ на инфекцию, хотя в инфицированных клетках и обнаруживаются признаки, характерные для воспаления. Например, как уже говорилось, активны гены, кодирующие белки, которые участвуют в регуляторных процессах вместе с интерфероном. По мнению некоторых исследователей, само воспаление в молочных железах, равно как и их резкая инволюция, то есть массовое уменьшение тканей (например, после аборта или внезапного прекращения лактации), может повышать риск злокачественного перерождения клеток.

Участие МMTV в развитии злокачественной опухоли, а возможно, и опухолей других локализаций позволяет выделить носительниц hMTV в группу риска наряду с пациентками из наследственно отягощенных семей, несущими мутации в генах предрасположенности.

Итак, благодаря усилиям специалистов в области клинической биохимии и генетики, молекуляр ной биологии, вирусологии и иммунологии удалось составить довольно емкий «молекулярный портрет» рака молочной железы. В то время как усилия ученых сосредоточены на выяснении причин и механизмов возникновения опухолей, врачи стремятся распознать опухоли на возможно ранних стадиях, которые хорошо поддаются лечению и прогнозу. Вот почему число параметров для диагностики рака и оценки его развития продолжает расти. О некоторых из них мы рассказали в предлагаемой читателю статье. Какие из таких маркеров окажутся наиболее эффективными и найдут применение в клинике, покажет ближайшее будущее.

Хотя неумолимая статистика говорит о росте заболеваемости раком молочной железы, у специалистов есть повод для оптимизма. Как заметил доктор Сельмон: «Насколько коварен рак, настолько изобретателен человеческий разум…» Несомненно, ранняя предклиническая диагностика уже сейчас позволяет значительно улучшить результаты лечения и добиться лучшей выживаемости пациенток, вернуть их к активной жизни и вселить надежду на полное выздоровление.

Рак молочной железы в 10% случаев передается по наследству. Если одна из двух копий, или аллелей, гена BRCA1 у женщины несет мутацию, то вероятность развития у нее рака молочной железы возрастает до 85%, а рака яичников — до 40%. У носителей таких мутаций возрастает и риск рака толстой кишки, а у мужчин — рака предстательной железы. В гене BRCA1 выявлено до 700 различных мутаций, которые характерны для жительниц определенных географических регионов. В случае мутаций в гене BRCA2 риск развития злокачественных опухолей груди и яичников сравнительно ниже. Показано, что в России частота мутаций в гене BRCA1 у пациенток с семейным раком молочной железы примерно на порядок выше, чем в гене BRCA2. Мутации в гене BRCA1 обнаруживаются в 16% семей с двумя и более близкими родственника ми, страдающими злокачественными опухолями груди в отсутствие рака яичников. Сочетание этих двух заболеваний в семье также обусловлено мутациями в генах BRCA1/BRCA2 (см. схему на стр. 21). Оказалось, что мутации в гене BRCA1 встречаются у 61% российских пациенток с семейными случаями рака молочной железы и яичников. Мутации в генах BRCA1/BRCA2 могут обусловить и другие формы рака. Если одни и те же мутации в гене BRCA2 у российских пациенток встречаются очень редко, то в гене BRCA1 преобладает особая мутация, которая характерна для европейской части России и встречается также в странах Европы.

Носительницы этих мутаций нуждаются в регулярном посещении маммолога, поскольку риск рака молочной железы у них достигает 80-90%, а их ближайшим родственникам рекомендована консультация врача-генетика. Кроме указанных имеются и другие гены, мутации или определенные аллельные варианты которых могут способствовать развитию опухолей молочной железы и некоторых других злокачественных новообразований. Однако этот вклад не столь значителен, как в случае генов BRCA1/BRCA2.

Читайте также:  Как понять что есть рак молочной железы

Предположение о возможной мутации возникает у генетика, если среди ближайших родственников пациентки обнаруживаются две и более больных раком молочной железы, если заболевание развивается в возрасте до 45 лет, при опухолях в двух молочных железах или при раке с множественными очагами опухоли, а также при наличии рака яичников.

Спорадический рак молочной железы развивается без особых очевидных причин, хотя имеются определенные, не связанные с наследственной предрасположенностью факторы, повышающие риск его возникновения.

источник

Диагностика опухолей молочной железы:

а) клиническая диагностика: опрос, осмотр, пальпация

б) лучевая диагностика: маммография, дуктография (введение контраста через специальную иглу в отверстие выводного протока, открывающегося на соске), КТ.

Рентген-картина РМЖ: 1) локальное уплотнение ткани железы – тень узла 2) деформация тяжистого рисунка 3) скопление мельчайших вкраплений извести — микрокальцинатов

г) цитологическая диагностика: мазки-отпечатки отделяемого из соска либо с изъязвленной поверхности

д) гистологическая диагностика биоптатов: пункционная, эксцизионная биопсии, трепанобиопсия, стереотаксическая биопсия

Пути раннего выявления рака – см. вопрос 6.1.

При подозрении на рак молочной железы дифференциальный диагноз проводят с:

а) фиброаденомой, кистой, локализованной формой мастопатии – в отличие от них рак отличается наличием кожных симптомов, изменениями соска, меньшей подвижностью образования, неровной поверхностью, увеличенными плотными л.у.

б) хроническим маститом – раковая опухоль более четко очерчета, отсутствует болезненность при пальпации уплотнения и лимфатических узлов, в анамнезе нет указания на острый мастит

в) саркомой молочной железы – она возникает в молодом или среднем возрасте, представляет собой быстрорастущее округлое образование эластической консистенции с неровной поверхностью; хорошо отграничена от окружающей паренхимы, подвижна; у рака твердая консистенция, менее четкие границы, есть кожные симптомы, втяжение и ограничение подвижности соска, чаще встречаются метастазы в подмышечные л.у.

У 80% женщин РМЖ является системным процессом, поэтому в большинстве случаев лечение комбинированное.

Лечение РМЖ: а) местно-регионарное (хирургическое и лучевое) и б) системное (химиотерапия, гормонотерапия).

Наилучшие результаты могут быть получены только при использовании комплексных методов терапии: хирургического, лучевого и лекарственного.

Методы лечения рака молочной железы

— мастэктомия по Холстеду-Майеру — удаление молочной железы, подмышечной клетчатки и обеих грудных мышц

— мастэктомия по Пети — удаление молочной железы, подмышечной клетчатки и малой грудной мышцы

— мастэктомия по Мадену – удаление молочной железы и подмышечной клетчатки с сохранением грудных мышц

— расширенная радикальная мастэктомия по Холдину-Урбану – удаление молочной железы, подмышечной клетчатки, обеих грудных мышц и парастернальных л.у. на стороне поражения

— радикальная секторальная резекция – удаление сектора молочной железы в едином блоке с жировой клетчаткой и л.у. подключично-подмышечно-подлопаточной зоны

Радикальные операции могут быть дополнены одномоментной либо отсроченной маммопластикой.

б) лучевое (облучению подвергается молочная железа, подмышечные л.у., над- и подключичные л.у., парастернальные л.у.):

— предоперационный курс – облучение операционного поля с целью необратимого повреждения клеток на периферии опухоли для предупреждения местного рецидива

— послеоперационный курс – облучение операционного поля и неудаленных л.у.

— интраоперационная – применяется при органосохраняющей операции, облучается ложе удаленной опухоли для девитализации оставшихся опухолевых клеток

— паллиативный курс — самостоятельная лучевая терапия при неоперабельных опухолях

в) химиотерапия (доксорубицин, циклофосфан, метотрексант, фторуроцил):

— неоадъювантная – для уменьшения размеров первичного опухолевого очага с целью дальнейшего выполнения органосохраняющих операций

— адъювантная – для уничтожения микрометастазов за пределами первичного очага

— паллиативная (химиотерапия «спасения»)

г) гормонотерапия (попытка пресечь пути действия эстрогенов на опухолевые клетки):

— прогестины (мегестрол, провера)

— ингибиторы ароматазы (летрозол, анастрозол, форместан)

источник

Опухоль молочной железы с метастазами соответствует IV стадии. В таких случаях основным видом лечения, как правило, становится системная терапия химиопрепаратами, гормональными препаратами, таргетными препаратами и их комбинациями. В некоторых случаях показаны местные виды лечения, такие как хирургическое вмешательство, лучевая терапия. Но их цель в данном случае – не ремиссия, а профилактика и лечение симптомов, улучшение состояния женщины, продление жизни.

Метастазы могут присутствовать изначально или возникнуть после наступления ремиссии. Чаще всего рак молочной железы метастазирует в лимфатические узлы, легкие, печень, кости, головной мозг.

Опухолевые клетки при раке груди могут обладать различными молекулярно-генетическими характеристиками, от этого зависит программа лечения. Например, раковые клетки могут иметь на своей поверхности большое количество рецепторов к эстрогенам, прогестерону, HER2. Если на поверхности клеток нет ни одного из трех видов рецепторов, рак называется тройным негативным.

Логично предположить, что метастазы должны иметь тот же молекулярный статус, что и первичная опухоль. Но при возникновении метастатических очагов после ремиссии так бывает не всегда. Например, опухоль может быть HER2-позитивной, а впоследствии трансформироваться в тройную негативную. Это сказывается на прогнозе, заставляет применять другие противоопухолевые препараты.

Определить молекулярно-генетические характеристики клеток в метастатических очагах помогает биопсия.

В зависимости от гормонального и HER2-статуса опухоли, при раке молочной железы IV стадии назначают следующие виды лечения:

При HER2-позитивных опухолях чаще всего назначают трастузумаб (Герцептин) – таргетный препарат, который блокирует рецептор HER2, в сочетании с химиопрепаратами или гормональными препаратами. Также могут быть назначены другие таргетные препараты, блокирующие HER2:

  • Пертузумаб (Перьета).
  • Трастузумаб эмтанзин (Кадсила). В этом препарате трастузумаб конъюгирован с химиопрепаратом эмтанзином и обеспечивает его прицельную доставку к опухолевым клеткам.

При гормонально-позитивных опухолях (ER- и PR-позитивных, соответственно, имеющих рецепторы к эстрогенам и прогестерону), как правило, назначают гормональные препараты: ингибиторы ароматазы или тамоксифен. Обычно у женщин репродуктивного возраста, у которых еще не наступила менопауза, применяют тамоксифен. Если метастатический рак приводит к выраженным симптомам, лечение начинают с химиотерапии, так как для достижения эффекта от гормональных препаратов требуется много времени.

Гормональные препараты могут быть назначены в сочетании с таргетными препаратами:

  • Паблоциклиб (Ибранса) блокирует циклинзависимые киназы – ферменты, которые участвуют в сигнальном пути, активирующем деление клеток.
  • Рибоциклиб (Кискали) также блокирует циклинзависимые киназы, применяется при гормонально-позитивном и HER2-негативном раке молочной железы в сочетании с ингибиторами ароматазы.
  • Абемациклиб (Верзенио) – блокатор циклинзависимых киназ, который применяется при прогрессировании рака после курса гормональной терапии.
  • Эверолимус (Афинитор) блокирует ферменты-протеинкиназы и ингибирует сигнальный путь, который приводит к делению клеток.

При HER2-негативных опухолях назначают химиотерапию, если рак является гормонально-позитивным – гормональные препараты. После курса химиотерапии может быть назначен олапариб (Линпарза) – таргетный препарат, который блокирует ферменты PARP, необходимые для восстановления поврежденной ДНК в опухолевых клетках.

При гормонально-негативных опухолях применяют химиопрепараты, так как гормональная терапия в таких случаях неэффективна.

Лечение продолжают до тех пор, пока опухоль реагирует на него, либо пока не возникли серьезные побочные эффекты, из-за которых прием препаратов приходится прекращать.

Если препараты, которые были эффективны ранее, перестали работать, лечение на этом не заканчивается. Врач может подобрать другие препараты. Дальнейший план терапии составляют исходя из предыдущей схемы лечения, возраста и состояния здоровья женщины, характеристик опухоли:

  • При неэффективности гормональной терапии можно назначить другие гормональные препараты, дополнить их таргетными препаратами. Если не помогает ни один гормональный препарат, остается химиотерапия.
  • При неэффективности химиотерапии можно сменить химиопрепарат – вариантов достаточно много. Каждый раз, когда опухоль перестает реагировать на химиопрепарат, повышается вероятность того, что она не будет реагировать и на новое лечение.
  • При неэффективности ингибиторов рецепторовHER2 можно назначить другой таргетный препарат из той же группы, в том числе в сочетании с химиопрепаратами.

Если все методы лечения исчерпаны, небольшая надежда все еще остается: иногда у пациентов есть возможность принять участие в клинических испытаниях. Во время них исследуют новые препараты, и возможно, они окажутся эффективны и смогут продлить жизнь.

Иногда хирургия и лучевая терапия при метастатическом раке помогают справиться с симптомами и улучшить состояние женщины. Показания к их назначению:

  • Если опухоль проросла в кожу, привела к изъязвлению и образованию открытой раны.
  • Если метастазов немного, и они могут быть удалены хирургически или другими методами.
  • Если костные метастазы создают риск патологических переломов.
  • Если опухоль распространяется на спинной мозг.
  • Если опухоль приводит к сильным болям.

В некоторых случаях при метастазах в печени можно провести радиочастотную аблацию: ввести в узел тонкий электрод в виде иглы и разрушить опухоль электрическим током высокой частоты. Применяют интраартериальную химиотерапию, химиоэмболизацию – процедуру, во время которой в печеночную артерию вводят химиопрепарат вместе с эмболами – микроскопическими частицами, которые перекрывают просвет сосуда и лишают опухолевый узел притока крови.

источник

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Передача сигналов Hippo / YAP связана с опухолегенезом и прогрессированием различных видов рака. Подавляя множество сигнальных каскадов, ресвератрол обладает сильной противоопухолевой и антиметастатической активностью. В настоящем исследовании мы демонстрируем, что ресвератрол уменьшает экспрессию генов-мишеней YAP. Кроме того, наши данные показали, что ресвератрол ослабляет инвазию клеток рака молочной железы посредством активации Lats1 и последующей инактивации YAP. Поразительно, мы также демонстрируем, что ресвератрол инактивирует RhoA, что приводит к активации Lats1 и индукции фосфорилирования YAP. Кроме того, ресвератрол в комбинации с другими агентами, которые инактивируют RhoA или YAP, демонстрирует более выраженное подавление инвазии клеток рака молочной железы по сравнению с однократным лечением. В совокупности эти данные свидетельствуют о положительном эффекте ресвератрола у пациентов с раком молочной железы, подавляя сигнальную ось RhoA / Lats1 / YAP и впоследствии ингибируя инвазию клеток рака молочной железы.

Первоначально было показано, что сигнальный путь Hippo регулирует размер органа, а его дисрегуляция способствует опухолегенезу. 1, 2, 3 Компоненты сигнального пути Hippo включают Mst1 / 2 и Lats1 / 2. Mst1 / 2 образует комплекс с белком-адаптером Sav1 для фосфорилирования и активирует Lats1 / 2,4, 5, приводя к инактивации да-ассоциированного белка (YAP) и TAZ, ключевых нисходящих эффекторов канала сигнализации Hippo.6, 7, 8, 9, 10 Хотя фосфорилированные YAP и TAZ сохраняются в цитозоле, нефосфорилированные YAP и TAZ транслокаты в ядро ​​и функционируют как активаторы транскрипции путем связывания с TEA-доменом (TEADs). Примечательно, что недавние исследования показали, что YAP11 и TAZ 12, расположенные ниже по потоку от Lats, связаны с прогрессированием опухоли в клетках рака молочной железы.

Семья Rho GTPase является членом суперсемейства Ras и имеет решающее значение для инвазии и метастазирования различных видов рака, включая рак молочной железы. Недавно RhoA участвовал в сигнальном пути Hippo. Действительно, RhoA было предложено опосредовать сигнал Lysophosphatidic acid (LPA) до YAP через активность Lats1 / 2 киназы.13 Кроме того, для активации RhoA необходим гирнейлгеранилпирофосфат, продуцируемый мевалонатным каскадом, что приводит к активации YAP / TAZ в клетках рака молочной железы14. Кроме того, RhoA имеет решающее значение для инвазии молочной железы, вызванной LPA- и эпидермальным фактором роста (EGF ).15, 16

Естественное полифенольное соединение ресвератрол (REV, транс-3,5,4-тригидроксистильбен) встречается в арахисах, винограде и разнообразных ягодах, а также в пищевых продуктах, таких как вино.17, 18 REV, как было показано, ингибирует инициирование и прогрессирование нескольких видов рака, включая рак молочной железы.19, 20, 21 Недавно мы показали, что REV ингибирует фосфорилирование EGF-рецептора для ослабления инвазии, вызванной LPA-инвазией рака яичников.22

Хотя сигнализация Hippo / YAP тесно связана с прогрессированием клеток рака молочной железы, мало известно влияние REV на сигнализацию Hippo и его связь с прогрессией рака молочной железы. Учитывая антипролиферативные и антиметастотические эффекты REV на множественные опухоли, исследование функции REV по передаче сигналов Hippo / YAP неоценимо для выявления терапевтического потенциала REV у больных раком. В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что REV ослабляет вторжение молочной железы, вызванное LPA- и EGF, путем инактивации YAP, что приводит к снижению регуляции транскрипционных продуктов YAP, таких как амфирегулин (AREG), богатый цистеином ангиогенный индуктор 61 (CYR61) и фактор роста соединительной ткани (CTGF). Кроме того, мы заметили, что REV эффективно снижает дефосфорилирование LPA- и EGF Lats1. Наконец, и что более важно, наши данные показали, что REV непосредственно инактивирует RhoA. В совокупности это исследование указывает на то, что REV уменьшает инвазию LPA- и EGF-индуцированных клеток рака молочной железы посредством координированной инактивации RhoA с фосфорилированием YAP, обеспечивая новые цели для прогрессирования рака молочной железы и указывая на потенциальную терапевтическую важность REV для пациентов с раком молочной железы.

REV, EGF и симвастатин были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). LPA был приобретен у Avanti Polar Lipids (Albaster, AL, USA). Все реагенты были самых чистых.

Рак молочной железы человека MDA-MB-231 и MDA-MB-468 были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, США) и использовались между 10-м и 30-м проходами. Клетки культивировали в RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой (HyClone, Logan, UT, США) и 1% пенициллина / стрептомицина (HyClone) в увлажненном инкубаторе при 5% CO2 при 37 ° C.

Клетки (5 × 104 клеток на лунку) высевали в 96-луночные планшеты в течение 24 часов, а затем предварительно обрабатывали указанными количествами REV в течение 24 часов в бессывороточной среде. Клетки смешивали с 0,5 мг / мл МТТ ((3,4,5-диметилтиазол-2-ил) -5-дифенилтетразолийбромид). После инкубации в течение 3 ч в каждую лунку добавляли 100 мкл диметилсульфоксида для извлечения красителя. Затем оптическую плотность измеряли при 540 нм с использованием фермент-скрепленного иммуносорбентного считывающего устройства для анализа (Bio-Rad, Berkeley, CA, USA).

Читайте также:  Если грудь разлагается при раке

Общая РНК (1 мкг) была загрунтована олиго (dT) и транскрибирована с обратной транскрипцией в комплементарную ДНК с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Moloney (Promega, Madison, WI, USA). Затем комплементарную ДНК подвергали ПЦР-амплификации с помощью наборов праймеров для AREG, CTGF, CYR61 и глицеральдегида 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH): AREG forward (5′-TGGGGAAAAGTCCATGAAAA-3 ‘), AREG reverse (5′-TGTGAGGATCACAGCAGACA-3′ ); CTGF вперед (5’-CCAATGACAACGCCTCCTG-3 ‘), CTGF обратный (5′-TGGTGCAGCCAGAAAGCTC-3′); CYR61 вперёд (5’-AGCCTCGCATCCTATACAACC-3 ‘), обратный CYR61 (5′-TTCTTTCACAAGGCGGCACTC-3′); и GAPDH вперед (5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3 ‘), GAPDH reverse (5′-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3’).

После того, как клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором, их инкубировали 10 мин при комнатной температуре в буфере для лизиса с радиоиммунопреципитацией с добавлением коктейльных таблеток ингибитора протеазы. Клеточные лизаты выскоблили из пластин. Затем их центрифугировали при 13000 об / мин. в течение 15 мин при 4 ° С, и концентрации белка определяли с использованием реагента для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA). Всего клеточных белков разрешали 8% -ным электрофорезом SDS-полиакриламидного геля и переносили на мембраны из поливинилидендифторида (Millipore, Temecula, CA, USA). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в TBS-T, инкубировали в течение 2 ч и затем зондировали указанными первичными антителами. Затем мембраны дважды промывали промывочным буфером (0,1% Tween 20 в TBS) и инкубировали с вторичными антителами в течение 2 часов. Мембрану дважды промывали промывочным буфером, а иммунореактивные полосы визуализировали ECL (Thermo Fisher Scientific Inc.). Первичные антитела использовались следующим образом: p-Lats1 (№ 9157, технология Cell Signaling, Danvers, MA, USA), Lats1 (№ 3477, технология сигнализации сотовой связи), p-YAP (# 4911, технология сигнализации соты), YAP ( sc-15407, Santa Cruz Biotechnology, Texas, CA, USA), AREG (sc-25436, Santa Cruz Biotechnology), CTGF (sc-25440, Santa Cruz Biotechnology), CYR61 (sc-13100, Santa Cruz Biotechnology), RhoA ( sc-179, Santa Cruz Biotechnology) и GAPDH (sc-25778, Santa Cruz Biotechnology).

Клетки фиксировали холодным метанолом в течение 15 мин и дважды промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором. Иммунофлуоресценцию проводили с анти-YAP-антителом (1: 100, sc-179, Santa Cruz Biotechnology) в течение ночи, как описано ранее.23 Ядрами были контрастированы 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом. Клетки промывали ледяным забуференным фосфатом физиологическим раствором три раза в течение 10 мин, а затем инкубировали с козьим антикроличьим вторичным антителом (зеленый, 1: 500, Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) при комнатной температуре. Клетки исследовали с помощью конфокальной микроскопии (× 200, LSM710, Carl Zeiss, Jena, Germany).

Тесты на инвазию in vitro проводили в трех повторностях с использованием набора для анализа инвазии с вставками с покрытием Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), как описано ранее.24 Объем 1 × 106 клеток на лунку добавляли в верхнее отделение камера инвазии с фармакологическими ингибиторами или без них в трансфицированных клетках. В нижний отсек мы добавили кондиционированную среду без сыворотки с аттрактантами или без них. Тесты на миграцию in vitro проводили в трех повторностях с использованием 48-луночной микрохемотаксической камеры, как описано ранее.25 Поликарбонатные фильтры с поливинилпирролидином типа I с мембранами пор 8 мкм (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, USA) использовали в этих модифицированные камеры Бойдена. После того, как образцы инкубировали в течение 6 (для миграции) и 17 ч (для инвазии) при 37 ° С, мигрированные или вторженные клетки последовательно фиксировали, окрашивали реагентами Дифф-Кик (Dade Behring Inc., Newark, DE, USA) и количественно подсчитывают количество ячеек в пяти случайных мощных полях для каждого репликта (× 200) с помощью светового микроскопа.

Клетки трансфицировали указанными плазмидами и короткими интерферирующими РНК (siRNAs) с Lipofectamine RNAiMAX и Lipofectamine 2000 (Invitrogen Carlsbad, Temecula, CA, США) в соответствии с инструкциями производителя, соответственно. Дополнительную ДНК RhoAV14 субклонировали в вектор pEGFPC1, а пустой вектор pEGFPC1 использовали в качестве отрицательного контроля. СиРНК, нацеленные на YAP и TAZ, были приобретены у Sigma-Aldrich.

Для анализа активности RhoA GTPase количество RhoA-GTP, связанное с RBD Rhotekin, определяли с использованием набора для анализа активации RhoA (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя, как описано ранее.26

Комплект анализа GLISA RhoA Activation Assay (Cytoskeleton, Denver, CO, USA) использовался для анализа GTP-RhoA в клетках в соответствии с инструкциями производителя.

Данные показаны как среднее ± s.d. Различия между двумя группами оценивали с использованием t-теста Стьюдента. Различия между тремя и более группами оценивались путем анализа дисперсии, а затем с помощью сравнительных тестов Bonferroni.

REV — небольшая молекула с химической структурой 3,5,4′-тригидрокси-транс-стильбена (рис. 1a). Чтобы определить оптимальную концентрацию REV, которая не вызывает апоптоз, мы сначала определили токсичность REV против клеток рака молочной железы. Обработка клеток REV при 25 мкМ показала> 90% (± s.d., N = 3) выживших клеток (рисунок 1b). Учитывая, что LPA27 и EGF, как было показано, индуцируют инвазию раковых клеток посредством экспрессии генов-мишеней YAP, включая AREG, CTGF и CYR61, мы затем определили влияние REV на экспрессию гена-мишеней YAP, индуцированных LPA- и EGF. Стимуляция клеток рака молочной железы с помощью LPA или EGF значительно увеличивала экспрессию РНК транскрипционных генов YAP (см. Рис. 1c и d). Однако предварительная обработка клеток REV эффективно ингибировала индуцированную LPA- или EGF экспрессию генов-мишеней YAP. Поэтому эти данные настоятельно свидетельствуют о том, что REV при концентрации, не имеющей значимой токсичности для тестируемых раковых клеток, ослабляет экспрессию РНК-экспрессирующей РНК и EGF генов-мишеней YAP.

Учитывая, что LPA13 и EGF28, 29 индуцируют экспрессию AREG, CTGF и CYR61 через активацию YAP, мы затем определяли эффект REV на активацию YAP, вызванной LPA- и EGF. Предварительная обработка клеток REV сильно ингибировала дефосфорилирование YAP, индуцированное LPA- и EGF (фиг. 2a и b), что указывает на то, что REV инактивирует YAP, тем самым ингибируя экспрессию РНК гена-мишеней с помощью мыши. Кроме того, мы наблюдали, что REV восстанавливает дефосфорилирование Lats1, вызванное LPA- и EGF. Учитывая, что фосфорилирование Lats1 регулирует инактивацию YAP, наши настоящие результаты показывают, что REV ослабляет активацию YAP, вызванную LPA- и EGF, путем восстановления фосфорилирования Lats1. В соответствии с этим наблюдением, анализ иммунофлуоресценции показал, что LPA и EGF транслоцируют YAP из цитозоля в ядро ​​и что REV эффективно блокирует транслокацию YAP в LPA и EGF (рис. 2c). Следовательно, эти результаты показывают, что REV подавляет активацию YAP, вызванную LPA- и EGF, что приводит к уменьшению экспрессии генов-мишеней YAP.

Ранее было показано, что LPA индуцирует активацию YAP, что приводит к секреции миграции клеток AREG и яичников27. Поэтому мы, далее, определим, заставляет ли REV ослаблять инвазию и миграцию клеток рака молочной железы, вызванные LPA- и EGF. Предварительная обработка клеток REV значительно уменьшала инвазию и миграцию клеток рака молочной железы, вызванные LPA- и EGF (рис. 3a и b). Что более важно, комбинированное лечение клеток с помощью REV и YAP siRNA показало более сильное ингибирование индуцированной LPA инвазии клеток рака молочной железы по сравнению с одиночной обработкой (рис. 3c). Чтобы определить роли YAP и TAZ в индуцированной LPA инвазии клеток рака молочной железы, мы трансфицировали клетки с помощью YAP- и TAZ-специфических сиРНК. Замедление экспрессии YAP или TAZ значительно уменьшало индуцированную LPA инвазию клеток рака молочной железы (рис. 3d). Кроме того, молчание как экспрессии YAP, так и TAZ показало более выраженное ингибирование индуцированной LPA инвазии клеток рака молочной железы, чем молчание экспрессии одного белка. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что как YAP, так и TAZ важны для инвазии молочной железы, вызванной LPA, и что REV эффективно подавляет вторжение клеток молочной железы, вызванное LPA.

RhoA был связан с индуцированным LPA30- и EGF3132,33 ингибированием Lats1 / 2 и последующей активацией YAP. Поэтому мы исследовали, активирует ли REV активированный LPA Lats1, ингибируя активацию RhoA. Поразительно, REV сильно ослабляет активацию RhoA, индуцированную LPA (рисунок 4a). Чтобы определить, действительно ли REV инактивирует RhoA, мы использовали конститутивно активный мутант RhoA (RhoAV14). REV снижает уровень активного RhoA, индуцированного RhoAV14 (рисунок 4b). Кроме того, трансфекция клеток RhoAV14 существенно уменьшала фосфорилирование YAP и впоследствии увеличивала экспрессию генов-мишеней YAP (рис. 4c). Однако предварительная обработка клеток REV значительно восстановила фосфорилирование YAP, подавленное RhoAV14. Кроме того, мы наблюдали, что REV подавляет индуцированную RhoAV14 инвазию клеток рака молочной железы (рис. 4d). Кроме того, REV снижает активность RhoA, вызванную RhoAV14 (рисунок 4e), что указывает на то, что REV непосредственно инактивирует RhoA. В соответствии с этими наблюдениями предварительная обработка клеток симвастатином, ингибитором геранлигеранилирования RhoA, 34, 35, значительно ингибировала дефосфорилирование, вызванное LPA, Lats1 и последующую активацию YAP (рисунок 4f). Кроме того, симвастатин сильно ингибировал LPAP-индуцированную транслокацию YAP в ядре (рис. 4g), а также инвазию клеток рака молочной железы (рис. 4h). Кроме того, предварительная обработка клеток как с помощью REV, так и с симвастатином показала более значительное подавление индуцированной LPA- и EGF инвазии клеток рака молочной железы по сравнению с таковой для одиночного лечения (рисунок 4i). Поэтому эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что REV ингибирует активацию YAP, индуцированную LPA, путем инактивации RhoA, и что REV в комбинации с симвастатином может быть использован для улучшения выживаемости пациентов с раком молочной железы.

Путь передачи сигналов Hippo / YAP был вовлечен в опухолегенез и прогрессирование различных типов рака.36, 37, 38, 39 В настоящем исследовании мы выяснили дополнительные антиинвазивные эффекты REV на клетки рака молочной железы. REV подавлял экспрессию гена-мишеней YAP, вызванных LPA- и EGF. Кроме того, мы наблюдали, что REV ослабляет инвазию LPA- и EGF-индуцированных клеток рака молочной железы посредством активации Lats1 и последующей инактивации YAP. Более интересно, мы впервые продемонстрировали, что REV инактивирует RhoA, что приводит к активации Lats1 и индукции фосфорилирования YAP. Таким образом, настоящие данные обеспечивают еще один основной механизм, посредством которого REV ослабляет инвазию рака молочной железы, указывая на положительные эффекты REV на эту смертельную болезнь.

Естественное соединение, REV усиливает апоптоз и подавляет рост опухоли через множественные сигнальные пути в различных раковых клетках.40, 41, 42, 43 Примечательно, что REV снижает инвазию клеток рака молочной железы, ингибируя действия FAK, 44 Rac и Cdc4245. Кроме того, было показано, что REV снижает регуляцию MMP-946 и подавляет передачу сигналов PI3K / Akt / Wnt / beta-catenin.47 Кроме того, REV усиливает противоопухолевые эффекты доксорубицина в клетках рака молочной железы.48 В настоящем исследовании мы показали, REV ингибирует путь передачи сигналов Hippo / YAP, что приводит к снижению регуляции экспрессии гена YAP и последующему ослаблению инвазии клеток рака молочной железы. Мы наблюдали, что REV уменьшает экспрессию AREG, CTGF и CYR61, вызванной LPA- и EGF. Кроме того, наши данные показали, что REV восстанавливает инактивацию Lats1, вызванную LPA- и EGF, и последующее дефосфорилирование YAP. Следует отметить, что REV увеличивал фосфорилирование Lats1 и YAP, указывая на то, что REV также ингибирует основную сигнальную ось Hippo / YAP.

Ранее сообщалось, что церивастатин, который используется для лечения гиперхолестеринемии путем ингибирования HMG-CoA-редуктазы, ингибирует транслокацию RhoA к клеточной мембране и, как следствие, активацию RhoA и инвазию клеток рака молочной железы.34 Интересно, что геранилгеранилпирофосфат, продуцируемый мевалонатным каскадом был необходим для активации RhoA, что привело к активации YAP / TAZ14. Недавние исследования показали диссонансные эффекты REV на активацию RhoA. Хотя обнаружены косвенные эффекты REV на RhoA, мы сообщили, что REV подавляет активацию рецептора EGF, индуцированную LPA, и последующее ингибирование передачи сигналов Ras / RhoA / ROCK в клетках рака яичников.22 Напротив, REV, как было показано, индуцирует активацию RhoA в глиобластомы.49 В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что REV непосредственно снижает активность RhoA. Обработка REV уменьшала основную активность RhoA. Кроме того, REV ингибировал активность RhoA, индуцированную LPA, и последующую активацию YAP в клетках рака молочной железы. Кроме того, REV уменьшает дефосфорилирование YAP, индуцированное RhoAV14. Следовательно, эффект REV на активность RhoA, по-видимому, зависит от контекста. Является ли REV инактивирует RhoA путем подавления HMG-CoA-редуктазы в настоящее время.

В заключение наши результаты показывают, что REV непосредственно инактивирует RhoA, и что инактивированный RhoA, в свою очередь, фосфорилирует YAP посредством активации Lats1, что приводит к подавлению экспрессии гена-мишени YAP и последующему ингибированию инвазии клеток рака молочной железы. Поэтому REV может использоваться для уменьшения инвазии и метастазов клеток рака молочной железы для улучшения результатов этого разрушительного заболевания.

Это исследование было поддержано грантом Программы фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования, науки и технологий (NRF-2014R1A2A1A11051091).

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

источник