Меню Рубрики

Стволовые опухолевые клетки при раке молочной железы

Первичные опухолевые стволовые клетки рака молочной железы метастазируют в кости, переключают фенотип и приобретают сигнатуру о тропическом типе

Метастазы в кости представляют собой обычное и серьезное осложнение при раке молочной железы, и в настоящее время обсуждается участие раковых стволовых клеток (CSC) в продвижении метастазов в кости. Здесь мы использовали модель «человек-в-мышах» для изучения образования метастазов в кости из-за колонизации колоний с первичной грудью.

Первичные CD44 + CD24-молочные CSC-подобные были трансдуцированы вектором люциферазы-лентивируса и вводились через подкожные и внутрисердечные (IC) пути у мышей с нежидкой / тяжелой комбинированной иммунодефицитом (NOD / SCID), несущих подкожные имплантаты костной ткани человека. Локализация, подобная CSCs, контролировалась визуализацией in vivo люциферазы. Метастатические кости CSC-подобных анализов анализировали с помощью иммуногистохимии и проточной цитометрии, а анализ экспрессии генов проводили с помощью микрочипов.

Грудь CSC-like колонизировала имплантированную человеком кость, что привело к ремоделированию кости. Метастатические поражения кости были гистологически очевидны экспрессией опухолевых клеток эпителиальных маркеров и виментина. Отобранные кости CSC-подобные были CD44-CD24 + и проявляли опухолевые способности после инъекции у вторичных мышей. CD44-CD24 + CSC-подобные показали четкую подпись о трофическом костном мозге, которая была обогащена генами, которые различают метастазы в кости от рака молочной железы от метастазов в других органах.

Грудь CSCs, подобно продвижению костного метастаза, и демонстрирует подпись CSCs-подобной кости. Эта подпись имеет клиническую прогностическую значимость, поскольку она эффективно отличает остеотропные раковые опухоли молочной железы от метастазов опухолей на других участках.

Опухоли молочной железы характеризуются фенотипической гетерогенностью. Они состоят из различных групп клеток, которые демонстрируют замечательную изменчивость во многих фенотипических чертах, включая различные метастатические способности и выживаемость после терапии. Гипотеза рака стволовых клеток (CSC), которая предполагает, что разнообразие между функционально важными свойствами отдельных клеток возникает из-за различий в их статусе дифференцировки, может объяснить внутриопухолевую гетерогенность, наблюдаемую при опухолях молочной железы (Campbell and Polyak, 2007; Shackleton et al. , 2009). Раковые стволовые клетки определяются как подмножество клеток, инициирующих опухоль, которые разделяют поверхностные маркеры с соматическими клетками стебля / предшественников их ткани происхождения. Они способны самовосстанавливаться, размножаться и дифференцироваться, чтобы вызвать гетерогенную популяцию опухолевых клеток (Clarke and Fuller, 2006; Rosen and Jordan, 2009). При раке молочной железы CSC идентифицируют как редкую популяцию CD44 + CD24-эпителиальноспецифичных антигеноподобных клеток, которые показывают туморогенность in vivo на основе анализа ксенотрансплантации у мышей, не страдающих ожирением / тяжелой комбинированной иммунодефицитной (NOD / SCID) (Al-Hajj et al, 2003; Shipitsin et al, 2007).

Известно, что клетки рака молочной железы имеют свойственный костный троп; действительно, у 70% пациентов с раком молочной железы развиваются метастазы в кости (Mundy, 2002). Метастатический процесс иногда происходит очень рано в естественной истории болезни, но может произойти на более поздних стадиях. В любом случае, как только опухоль распространилась на кость, рак уже не излечимый (Mundy and Sterling, 2008). В последних докладах были рассмотрены молекулярные механизмы, лежащие в основе распространения клеток рака молочной железы в кости, и привели к идентификации дискретных наборов остеотропных генов, связанных с костным тропизмом (Kang et al, 2003; Minn et al, 2005; Liu et al, 2007; van den Hoogen et al, 2010). Доказательства того, что CSC ответственны за метастазы в кости, по-прежнему не являются окончательными из-за трудностей в изоляции CSC и отсутствия достоверной модели на животных (Liu et al, 2010; van den Hoogen et al, 2010; Buijs et al, 2011).

В этом исследовании исследуется способность метастазов к метастазированию неметастатическим CSC человека. Модель NOD / SCID-человек-в-мышах была использована для инъекции CD44 + CD24-CSC-подобных, выделенных из метастатического первичного рака молочной железы без костной ткани (Kuperwasser et al, 2005; Roato et al, 2010). Этим мышам имплантировали подкожно (SC) фрагментом человеческой кости, чтобы установить микроокружение человека. Введенная грудка CD44 + CD24-CSCs-like приобрела способность метастазировать имплантированную кость и переключилась на фенотип CD44-CD24 +, сохраняя при этом туморогенные способности in vivo. Выделенные из кости CD44-CD24 + CSC выражали сигнатуру значительного обогащения наборов генов, биологически релевантных в процессе распространения рака, которые сохранялись в последующих проходах в отсутствие окружающей костной ткани (Subramanian et al, 2005). Эта подпись, полученная от CSC, имеет значение для клинического прогноза, поскольку она эффективно отличает остеотропные раковые опухоли молочной железы от метастазов опухолей на другие участки.

Грунтовые ЦНС ранее были выделены и охарактеризованы для экспрессии маркеров стельности, показавших CD44 + CD24-фенотип и для опухолегенного потенциала (Bussolati et al, 2009). Опухолевые образцы были получены у соглашающегося пациента, согласно комитету по этике больницы Сан-Джованни-Баттиста в Турине, Италия. Гистологический анализ показал HER2-отрицательный лобулярно-инфильтрационный карциному плеоморфного типа, экспрессирующий рецептор эстрогена в

60% клеток. Как описано выше (Bussolati et al., 2009), клеточная суспензия, полученная из опухолевой ткани, обрабатывалась, и были получены маммосферы. Эти маммосферы изучались для их способности метастазировать в кости, поскольку у пациентов с раком молочной железы часто развиваются метастазы в кости (Smid et al, 2008). CD44 + CD24-CSC-подобные были трансдуцированы вектором экспрессии люциферазы-лентивируса, происходящим от Luc-CSC-подобных. Как грудные CSC-подобные, так и Luc-CSC-подобные были введены у мышей, чтобы исключить возможные модификации опухолегенного фенотипа из-за лентивирусной трансдукции.

Экспериментальные животные обрабатывались в соответствии с фактическими национальными и международными руководящими принципами (итальянский законодательный декрет 116/92 и директивой Европейского сообщества 86/609 CEE) и в соответствии с разрешением, предоставленным Министерством здравоохранения Италии (в соответствии с DM 44 / 1994-А и последующая интеграция). Все ортотопические модели ксенотрансплантатов были установлены у мышей NOD / SCID, как описано ранее (Roato et al, 2010). Свежий фрагмент человеческой кости, полученный из отброшенной головки бедренной кости взрослого пациента, представленный на общую замену суставов (после информированного согласия пациента), был пересажен SC на левый фланг 15-тилетних мышей 15 NOD / SCID (Charles River Laboratories Italia, Calco, Италия). У шести 5-недельных мышей груди CSCs-like (три мыши) и Luc-CSCs-like (три мыши) вводили SC близко к костному имплантату. У еще шести мышей ICSC-подобные (три мыши) и Luc-CSC-подобные (три мыши) были введены IC-маршрутом, чтобы продемонстрировать реальную способность CSC метастазировать в кости. Для инъекций SC 1,5 × 105 грудных ЦСК ресуспендировали в PBS и Matrigel 1: 3 (BD ​​Biosciences, Бедфорд, Массачусетс, США) и вводили в объеме 40 мкл с использованием иглы 25 калибра. Для IC-маршрута 1 × 103 CSC-подобных были введены в левый желудочек. Развитие опухолевых масс и метастазов в кости и других органах контролировалось системой визуализации in vivo (IVIS) в течение 45 дней после инъекции. Для оценки вторичной генерации опухоли маммосферы, полученные из метастатического поражения в кости, имплантированной человеком, культивировали в течение 1 недели. Поддержание фенотипа CSC подтверждали проточной цитометрией для экспрессии CD44 и CD24, а затем клетки повторно инъецировали в еще шесть мышей (три SC и три IC) с теми же экспериментальными условиями, что указаны выше. Присутствие циркулирующего человеческого IgG у сывороток мышей продемонстрировали с помощью ELISA IgG человека, приобретенного ICL Inc. (Анкара, Turkiye).

Векторные запасы получали путем переходной трансфекции плазмиды переноса люциферазы, упаковочных плазмид pMDLg / pRRE и pRSV.REV и плазмиды овальной оболочки везикулярного стоматита (VSV) pMD2.VSV-G (15, 6,5, 2,5 и 3,5 мкг соответственно , для 10-см блюд) в 293Т. Через 12-14 ч трансфекционный раствор удаляли и клетки дважды промывали 1 × PBS. Среда была заменена и собрана через 24 часа. Вирусные супернатанты фильтровали, используя фильтрующую колбу с низким содержанием белка 0,45 мкм (Millipore, Vimodrone, Italy), и вирусные частицы концентрировали ультрацентрифугированием, как описано (Follenzi et al, 2000). Определение концентрации антигена вируса p24 проводили с помощью HIV-1 p24 Основной профиль ELISA (PerkinElmer Life, Waltham, MA, USA).

РНК груди ресуспендировали в Opti-MEM в присутствии 8 мкг мл-1 полибрена (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) и высевали в 96-луночные круглодонковые пластины. Затем к клеткам добавляли лентивирусы с высоким титром (210 нг p24 гэг-эквивалентных частиц) и клетки инкубировали в течение 4 часов.

Грудь Luc-CSC-like была протестирована на экспрессию люциферазы с использованием системы анализа люциферазы (Promega Corp., Мэдисон, штат Висконсин, США), как описано в наборе протоколов. Вкратце, клетки промывали PBS и лизировали буфером для лизиса RLB, выполняя один цикл замораживания-оттаивания. Двадцать микролитров клеточного лизата добавляли в люминометрическую трубку, содержащую реагент для анализа люциферазы, и считывали, выполняя задержку измерения 2 с последующим измерением 10 с, считываемым для активности люциферазы. Важно отметить, что мы не наблюдали существенных различий в фенотипах опухолей, связанных с трансляцией лентивирусов, о чем свидетельствует гистологический вид, анализ проточной цитометрии (см. Дополнительный рисунок S2A и B) и анализ микрочипов родительской груди CSCs-like и Luc-CSC-подобный.

Для биолюминесцентной визуализации (BLI) мышей анестезировали ингаляцией изофлураном и затем интраперитонеально инъецировали 200 мкл 15 мг-1 ?-люциферина (Caliper Life Science, Hopkinton, MA, USA). Сигналы биолюминесценции контролировались с использованием серии IVIS system 2000 (Xenogen Corp., Alameda, CA, США), состоящей из высокочувствительной охлаждаемой ПЗС-камеры. Два кинетических биолюминесцентных поглощения были собраны между 0 и 20 мин после инъекции ?-люциферина для подтверждения пикового излучения фотонов, который регистрировался как максимальный отток фотонов в секунду; время визуализации варьировалось от 1 до 60 с, в зависимости от количества активности люциферазы. Данные анализировались с использованием полного излучения потока фотонов (фотонов s-1) в интересующих областях, определенных вручную. В различные моменты времени после имплантации опухоли (25, 35 и 45 дней) мышей отображали с использованием системы IVIS 2000.

Чтобы выделить метастатические клетки из остеолитических повреждений, человеческую имплантированную костную ткань извлекали, мелко измельчали, а затем расщепляли путем инкубации в течение 30 мин при 37 ° С в DMEM, содержащей коллагеназу I (Sigma-Aldrich). После нейтрализации коллагеназы клетки промывали сбалансированным солевым раствором Хэнкса (Lonza, Basel, Switzerland), а эритроциты лизировали раствором лизиса клеток крови (Promega Corp.). Клеточная суспензия была вынуждена через градуированную серию сеток для отделения компонентов клетки от стромы и агрегатов. После фильтрации одиночные клетки высевали в бессегрессивную селективную среду DMEM-F12 (Gibco, Invitrogen, Monza, Italy), дополненную основным фактором роста фибробластов 10 нг мл-1, эпидермальным фактором роста 20 нг мл-1 (EGF, PeproTech , Лондон, Великобритания), 5 мкг мл-1 инсулина и 0,4% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich), чтобы избежать присутствия неопластических загрязняющих клеток. Через 1 неделю наблюдалось появление неадгезионных сферических кластеров клеток, то есть маммосфер. Маммосферы собирали на дне конической трубки путем спонтанного осаждения для удаления неживых клеток. Через 5 дней маммосферы собирали осторожным центрифугированием и дезагрегировали с неферментативным раствором диссоциации клеток (Sigma-Aldrich). Чтобы проанализировать фенотип этих костных млекопитающих, диссоциированные клетки подсчитывали и окрашивали для анализа проточной цитометрии с помощью CD44PE и CD24FITC человека (BD Pharmingen, Bedford, MA, USA). Для каждого антитела мы также использовали относительный контроль изотипа. Образцы были проанализированы на инструменте FACs Calibur и разработаны Flowjo (Tree Star, Ashland, OR, USA).

Иммуногистохимию проводили на тканях, закрепленных в 10% нейтрализованном буфером формалине, а костные ткани декальцифицировали с помощью ЭДТА до мягкости. Ткани вставляли в парафин, секции депарафинизировали, регидратировали через градуированные спирты и подвергали антигенному извлечению для иммуногистохимии. Разделы были окрашены для H & E для морфологических исследований. Присутствие сосудов человека было продемонстрировано окрашиванием анти-CD34, клоном QbndN / 10 (NeoMarkers, Freemont, CA, USA), тогда как опухолевые клетки окрашивали мышиными моноклональными антителами против низкомолекулярных цитокератинов (CK AE1 / AE3, клон AE1 / AE3 / PCK26), эпителиальный мембранный антиген (EMA, клон E29) и виментин (клон R9) из DAKO (Glostrup, Дания) и CD44 (клон C26) и CD24 (клон ML5) от BD Pharmingen. Чтобы идентифицировать коллагеновые волокна на новой кости, трихромное пятно было выполнено с помощью трихромного пятна Gomori (DAKO). TRAP окрашивали для идентификации остеокластов в соответствии с инструкциями производителя (Roche, Basel, Switzerland).

Суммарную РНК экстрагировали мини-комплектом miRNeasy (Qiagen, Милан, Италия). Клетки собирали в виде гранул, гомогенизировали непосредственно в реакторе лизиса QIAzol (максимум 107 клеток в 0,7 мл реагента) и обрабатывали в соответствии с протоколом производителя. Контроль качества РНК проводили на Bioanalyzer 2100 (Agilent, Berkshire, UK). Биотинилированную антисмысловую РНК (aRNA) получали из 500 нг общей РНК с использованием набора амплификации Illuminina RNA Amplion Kit (Ambion, Austin, TX, США) в соответствии с указаниями производителя, а контроль качества выполняли на Bioanalyzer 2100 (Agilent). Маркированную аРНК гибридизовали на экспрессионной линии Illumina HumanHT-12 v4 BeadChips в течение 16 часов. Затем гибридизованные BeadChips промывали, окрашивали стрептавидином-Cy3 и отсканировали на BeadStation 500 (Illumina, San Diego, CA, USA).

Данные необработанных микрочипов обрабатывались и анализировались с помощью программного обеспечения GenomeStudio (Illumina) в соответствии со стандартными процедурами. Вкратце, данные на уровне борта были обобщены и нормализован кубический сплайн. Затем образцы были организованы в следующие группы: (i) груди CSCs-like, CD44 + CD24- (дубликат); (ii) Люк-CSC-подобный, CD44 + CD24 (синглет); (iii) костно-изолированные метастатические CSC-подобные, CD44-CD24 + (дубликат). Впоследствии образцы были (iv) выращены in vitro в виде сфероидов (синглет) или (v), выращенных в подкожных имплантатах (дубликат). Вариант «Illumina Custom» t-теста, реализованный в GenomeStudio, использовался для выбора генов с дифференциальной экспрессией между CSC-подобным и костно-изолированным метастатическим CD44-CD24 + CSC-подобным (значение P 3). Это привело к тому, что было выбрано 860 зондов (из которых 710 были усилены и 150 были подавлены в костных метастазах). Впоследствии пробы отфильтровывали, чтобы удалить те, которые показывают дифференциальную экспрессию (смена смены> 1,5) между грудными CSC-подобными и Luc-CSC-подобными. Этот фильтр уменьшал настроенные зонды до 480 и подавлял подачу зондов до 100. Наконец, зонды с повышением и понижением были проверены на предмет их изменения (более чем в два раза) по сравнению с похожими на грудную клетку и производными костно-изолированного метастатического CD44- CD24 + CSC-подобные, то есть сфероиды и подкожные имплантаты. Девяносто шесть upregulated и 23 downregulated зонды, соответствующие 88 и 22 генам, соответственно, прошли этот последний фильтр и в совокупности определили подпись CSCs как подобие кости (см. Дополнительную таблицу S3). Иерархическая кластеризация выполнялась с использованием программного обеспечения GEDAS (Fu and Medico, 2007). Набор данных микрочипов линии клеток молочной железы был создан Kang et al (2003) и получен как дополнительный материал на веб-сайте издателя. Набор данных метастазов рака молочной железы, сгенерированный Zhang et al (2009), был получен из базы данных Gene Expression Omnibus (GSE14020). GSE14020 представляет собой совокупность двух наборов данных, полученных с двумя различными типами массивов Affymetrix (Санта-Клара, Калифорния, США). Чтобы гомогенизировать их, данные были перекрестно отображены на основе наборов зондов и масштабированы по медианному выражению. Анализ генного обогащения (GSEA, Mootha et al, 2003; Subramanian et al., 2005) по нашим данным экспрессии, отфильтрованным для обнаружения, проводили онлайн с использованием приложения Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/downloads .jsp). Гены, представленные несколькими зондами, сжимались до зонда с максимальным значением. Из базы данных молекулярных подписи GSEA мы выбрали для анализа сборники C2 (курированные генные множества, файл: c2.v3.symbols.gmt) и C5 (Gene Ontology; файл: c5.v3.symbols.gmt). Статистика обогащения была выполнена с настройками по умолчанию и меткой Signal_to_Noise с 1000 перестановками. Анализ генного обогащения с учетом CSC-подобной подписи костного трофизма в качестве набора генов был запущен на опубликованных наборах данных (Kang et al, 2003; Zhang et al, 2009) для тестирования на обогащение генов дифференциальной экспрессией между костным метастатическим и не- метастатических клеток или тканей. Оценка коэффициента набора генов была рассчитана из оценки Ratio_of_classes для генов в наборе, а FDR оценивалась с 1000 перестановками.

Чтобы проанализировать экспрессию IL-6, IL-8 и CCL20 человека у мышей, мы использовали систему обнаружения мультианализа Milliplex Map в соответствии с инструкциями производителя. Обнаружение молекулы проводили с помощью прибора Luminex 200 (Luminex Corporation, Austin, TX, США), и данные анализировались с помощью программного обеспечения аналитика MILLIPLEX.

Чтобы проверить способность CSCs груди — как метастазировать кости, мы использовали CSCs, как ранее выделенные из первичной опухоли молочной железы. Эти клетки были CD44 + CD24-, росли как маммосферы и выражали маркеры стволовых клеток Oct-4 и нестин, но не маркеры дифференцировки CK14, CK18 и α-SMA. Они росли у мышей SCID и были способны генерировать серийные опухоли при повторной инъекции другим мышам (Bussolati et al, 2009). После выделения из первичной опухоли эти клетки CSC для груди вводили SC или через IC-путь у мышей NOD / SCID, несущих небольшой кусочек человеческой кости, ранее имплантированный во фланг. Введение человеческой кости у мышей позволило нам изучать видоспецифическим образом взаимодействие между CSC-подобным молоком и микроокружением костей. Перед инъекцией SC и IC мы трансдуцировали эти CSCs груди подобно люциферазу-лентивирусному вектору (Luc-CSCs-like), чтобы контролировать их локализацию in vivo. В дополнительной таблице S1 указано количество мышей в экспериментальных группах, выживаемость мышей, проценты приживления костей и метастазы в кости и легких. Чтобы проанализировать интенсивность сигнала люциферазы, высвобожденного из Luc-CSC-подобных, увеличение количества Luc-CSCs высеивали в многолуночную пластинку и подвергали визуализации IVIS. Мы определили сигнал люциферазы, начиная с 5 × 102 клеток, и его интенсивность была примерно пропорциональна разным клеточным разведениям (дополнительный рисунок S1). После инъекции Luc-CSC-like SC мы контролировали рост опухоли в разные моменты времени в течение 45 дней. Через двадцать дней после инъекции Люком-CSCs первичные опухоли были макроскопически очевидны, и обнаружены локализации костей (рис. 1A). Интенсивность сигнала в кости постепенно возрастала в течение исследования, со временем становилась сильнее в кости, чем в опухолевой массе (рис. 1В и С). Этот результат был подтвержден количественной оценкой средней интенсивности люциферазы в кости и в массе опухоли SC, которая показала более высокое значение в кости, чем в массах SC, особенно на 45 день, P в 10 раз, включая карбоангидразу IX, которая, как известно, способствует ЕМТ и связана с высокими показателями метастазирования (Shin et al, 2011); два хемокина, CCL20 и IL-8, участвующие в метастазирующем процессе опухоли (Li et al, 2003; Beider et al, 2009); инсулиноподобный фактор-связывающий фактор роста 1, который связан с результатом рака молочной железы (Goodwin et al, 2002); и ранний ответ на рост транскрипции-1, который участвует в прогрессировании рака простаты и усиливает транскрипцию и секрецию IL-8 (Ma et al, 2009). Мы обнаружили CCL20 на более высоких уровнях в сыворотке мышей с метастазами в кости, чем у мышей без метастазов и контролей (дополнительный рисунок S5). IL-8 и IL-6 обнаруживали только в сыворотках мышей с метастазами в кости (371 ± 65,2 и 826 ± 597,1 пг мл-1 соответственно). Эти хемокины и цитокины могут быть ответственны за привлечение CSC-подобных костей и могут поддерживать фенотипический переключатель.

источник

Стволовые клетки молочной железы, связанные с беременностью, также связаны со стволовыми клетками, выявленными при раке молочной железы

Ученые выяснили, каким образом рак молочной железы узурпирует полномочия стволовых клеток молочной железы. 11.08.2014 г. В период беременности некоторые гормоны вызывают рост специализированных стволовых клеток молочной железы, чтобы затем создать необходимые для лактации вырабатывающие молоко клетки. Ученые обнаружили, что стволовые клетки молочной железы, связанные с беременностью, также связаны со стволовыми клетками, выявленными при раке молочной железы. Поняв фундаментальный механизм развития молочных желез в период беременности, ученые нашли новый путь лечения агрессивного рака молочной железы.

Ученые определили основной молекулярный путь, связанный с агрессивным раком молочной железы. Этот же путь необходим для стволовых клеток молочной железы, способствующих развитию лактации в период беременности. Некоторые препараты способны сорвать этот путь и могут вмешиваться в процесс прогрессирования рака молочной железы.

В период беременности возникает новая популяция молочных стволовых клеток, отличная от той, которая участвует в развитии молочных желез небеременных женщин. Эти стволовые клетки реконструируют молочную железа, подготавливая ее к лактации. Как правило, эти стволовые клетки только способствуют ранним событиям ремоделирования и выключаются на время, когда начинается выработка молока.

Однако ученые обнаружили, регулирующие активацию стволовых клеток сигналы в период беременности могут быть захвачены раковыми клетками, вследствие чего производятся быстро растущие более агрессивные опухоли. Этот нормальный путь развития стволовых клеток заканчивается развитием рака молочной железы.

Связь между беременностью и раком молочной железы давно известна. Но связь между беременностью и риском рака молочной железы является сложной. В то время как рождение ребенка снижает риск развития у женщины рака молочной железы на более поздних этапах ее жизни, имеется также повышенный краткосрочный риск развития высоко агрессивной формы рака молочной железы после каждой беременности. Данное исследование позволяет предположить, что молекулы, имеющие значение для поведения стволовых клеток в период беременности, могут способствовать агрессивному раку молочной железы.

Выводы ученых не следует истолковывать в качестве причины, чтобы избежать беременности. Узурпированный раковыми клетками сигнальный путь не является причиной рака молочной железы. На самом деле это может ухудшить или ускорить рак, вызванный другими факторами, такими как основные мутации или генетическая предрасположенность.

Читайте также:  Дольковый рак молочной железы признаки

Ученые считают, что это работа не говорит о фактической причине рака. Однако она объясняет то, что может произойти, как только начат рак. Чтобы заболеть раком, нужно сначала начать с онкогена – гена, несущего мутацию и имеющего потенциал, чтобы инициировать рак.

Исследователи сосредоточились на рецепторном белке клеточной поверхности – бета-3 интегрине (CD61), для которого доказана связь с метастазированием и устойчивостью к противораковым препаратам. CD61 представляет собой хороший маркер для инкриминируемого сигнального пути, участвующего в развитии стволовых клеток в период беременности и рака молочной железы. CD61 легко обнаруживается и может быть использован для диагностики и лечения случаев рака молочной железы. Обнаружение CD61 может помочь врачам определить, имеют ли они дело с более агрессивной, но излечимой формой рака молочной железы. Кроме того, существуют препараты, которые блокируют CD61 сигнализацию, что может быть еще одним потенциальнымметодом лечения. Источник: University of California

источник

Роль опухолевых стволовых клеток в развитии и прогрессировании рака молочной железы: возможности терапии, направленной на опухолевые стволовые клетки

*Импакт фактор за 2017 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Реферат. Недавние исследования выявили небольшую популяцию высокоонкогенных клеток, обладающих свойствами стволовых клеток при раке молочной железы (РМЖ) у человека и других солидных опухолях, которые могут считаться источником развития опухоли; эти клетки относятся к опухолевым стволовым клеткам (ОСК). Доклинические данные свидетельствуют о том, что текущая стратегия лечения РМЖ приводит к обогащению ОСК, способствуя развитию резистентности к химиотерапии и лучевой терапии, однако сильной корреляции с клиническими данными и прогнозом до сих пор не установлено. Важно отметить, что преодоление неудач лечения путем эффективного направленного воздействия на ОСК может быть привлекательным подходом, который потенциально ведет к улучшению клинических исходов у пациентов, страдающих РМЖ. Некоторые доклинические исследования показали обнадеживающие результаты, которые поддерживают эту гипотезу. Целью данного обзора является обобщение роли ОСК при рецидиве РМЖ и развитии резистентности, а также обсуждение текущих попыток воздействия на ОСК.

Реферат. Недавние исследования выявили небольшую популяцию высокоонкогенных клеток, обладающих свойствами стволовых клеток при раке молочной железы (РМЖ) у человека и других солидных опухолях, которые могут считаться источником развития опухоли; эти клетки относятся к опухолевым стволовым клеткам (ОСК). Доклинические данные свидетельствуют о том, что текущая стратегия лечения РМЖ приводит к обогащению ОСК, способствуя развитию резистентности к химиотерапии и лучевой терапии, однако сильной корреляции с клиническими данными и прогнозом до сих пор не установлено. Важно отметить, что преодоление неудач лечения путем эффективного направленного воздействия на ОСК может быть привлекательным подходом, который потенциально ведет к улучшению клинических исходов у пациентов, страдающих РМЖ. Некоторые доклинические исследования показали обнадеживающие результаты, которые поддерживают эту гипотезу. Целью данного обзора является обобщение роли ОСК при рецидиве РМЖ и развитии резистентности, а также обсуждение текущих попыток воздействия на ОСК.
Ключевые слова: опухолевые стволовые клетки, фенотип CD44+/CD24низкий, химиорезистентность, терапия, направленная на опухолевые стволовые клетки.
Введение
В течение последних нескольких лет экспериментальные данные подтверждают, что опухоли, включая РМЖ, являются гетерогенной популяцией клеток с различными биологическими свойствами [1–5]. Было высказано предположение о том, что онкогенный процесс сохраняется у небольшой группы в популяции клеток, которые называют опухолевыми стволовыми клетками (ОСК), что составляет лишь 1–5% от всех опухолевых клеток [5]. ОСК определены по их способности инициировать развитие опухоли у иммунокомпрометированных мышей и дифференцироваться в опухолевые клетки, образующие опухоль, из-за их способности к самоподдержанию и стимуляции дифференциации потомства [6, 7]. ОСК демонстрируют несколько особенностей, которые могут иметь большое значение в понимании процессов канцерогенеза. Они обладают высокой способностью к инвазии, клональной эволюции, а также состоянию покоя; стимулируют формирование кровеносных сосудов и являются инициирующим фактором подвижности клеток [8, 9]. Кроме того, они участвуют в стимуляции канцерогенеза: появляется все больше доказательств того, что они способствуют прогрессии опухоли [10] и метастазированию [11, 12].
В последнее время активно изучается роль ОСК при РМЖ. Высокоонкогенные клетки, обладающие свойствами ОСК, были выделены от РМЖ на основании экспрессии поверхностных клеток и других маркеров. Более специфичные ОСК молочной железы (ОСК-М) несут фенотип CD44+/CD24низкий [5] и имеют гиперэкспрессию альдегид-дегидрогеназы (ALDH) 1 – фермента детоксикации, который регулирует окисление внутриклеточных альдегидов и играет важную роль в дифференцировке стволовой клетки [13]. Совсем недавно описано определение маркеров, включающих снижение активности протеасомы 26S и α6- и β1-интегринов [14, 15]. Кроме того, ОСК-М могут быть выделены путем формирования сферических кластеров (mammospheres) в суспензионных культурах в результате их способности к самообновлению [16]. Необходимо также отметить, что они могут быть определены так называемыми клетками «боковой популяции», которые обладают способностью выкачивать флуоресцентный краситель H33342 через ABCG2 – трансмембранный транспортер, который гиперэкспрессирован в ОСК-М [17].
Гипотеза ОСК
Гетерогенность опухоли известна уже давно, и концепция о том, что опухоли могут происходить из редкой популяции клеток со свойствами стволовых, была предложена 150 лет назад [18]. Однако гипотеза ОСК была оценена и поддержана совсем недавно благодаря достижениям в области молекулярной биологии, которые позволили разработать новые методы и модели канцерогенеза на животных, чтобы подвести итоги болезни человека. Гипотеза ОСК в настоящее время набирает позиции по отношению к классической модели, которая придает особое значение случайным мутациям как основному источнику опухолевой трансформации [19]. Известно, что ткань обычно происходит из органоспецифичных стволовых клеток, которые подвергаются самообновлению и дифференцировке в типы клеток, которые составляют каждый орган [20]. В соответствии с гипотезой ОСК, опухоли возникают из ткани либо стволовых клеток или их ближайших потомков, которые приобретают способность к безграничному самообновлению. Когда ОСК подвергаются асимметричному делению, это создает одну дочернюю клетку, которая является точной копией оригинальной ОСК и способна инициировать развитие опухоли, а другая дочерняя клетка обладает ограниченным потенциалом к самообновлению, но высокой скоростью пролиферации. Вследствие этого опухоли содержат клеточную составляющую, которая сохраняет ключевые свойства стволовых клеток и большое количество быстроделящихся клеток, образующих основную массу опухоли [21, 22]. Недавно было показано, что несколько ранних онкогенных событий могут играть роль в процессе развития РМЖ. В частности, амплификация HER2/neu, которая определяется в 15–20% случаев РМЖ человека, приводит к более частому и симметричному самообновлению и делению ОСК, способствуя увеличению количества ОСК в опухолевой ткани; было также отмечено, что непрерывная экспрессия необходима для поддержания канцерогенеза [23, 24]. Кроме того, потеря функции PTEN (phosphatase and tensin homolog) выявляется приблизительно в 40% случаев РМЖ, также сообщалось, что увеличивается количество ОСК [25].
Гипотеза ОСК играет роль в предупреждении, выявлении и лечении РМЖ [26]. Более того, гетерогенность РМЖ объясняется некоторыми исследователями возможностью функции ОСК, которые составляют клетки, из которых она происходит [27]. Также предполагается, что гипотеза ОСК может быть включена в молекулярное стадирование РМЖ в том смысле, что ОСК могут генерировать клетки с определенным типом ограниченной и аберрантной дифференциации, которые можно перенести на молекулярные подтипы РМЖ [28, 29]. Предполагается, что молекулярный подтип РМЖ с низким клаудином (трансмембранный белок), который включает в себя тройной негативный инвазивный РМЖ, наиболее похож на стволовую опухоль, потому что имеет характеристики, схожие с ОСК, такие как фенотип CD44+/CD24низкий и экспрессия ALDH1, которые в нем обнаружены [30].
С другой стороны, существует все больше доказательств того, что есть определенная связь между ОСК и эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT) [31, 32]. Подробно описано, что EMT играет ключевую роль в преобразовании как нормальных, так и опухолевых эпителиальных клеток в производные с более мезенхимальным фенотипом. В контексте опухоли в результате EMT клетки приобретают биологические признаки, ассоциированные с низкодифференцированными опухолями, включая подвижность, способность к инвазии и повышенную устойчивость к апоптозу – признаки, связанные с метастазированием [33, 34].
Присутствие ОСК может способствовать развитию лекарственной резистентности и рецидива РМЖ. В настоящее время лекарственные препараты направлены на быстропролиферирующие клетки, а не на клетки, которые редко делятся, такие как ОСК, таким образом, не учитывают тот факт, что происходит развитие и обновление опухоли [8]. Следовательно, можно утверждать, что если ОСК имеют б|ольшую чувствительность к лечению, чем большинство опухолевых клеток, лечение не позволит радикально удалить опухоль, т.к. уменьшение размеров опухоли влияет на дифференцированную часть не-ОСК. С другой стороны, изолированное воздействие на ОСК может быть неуспешным, особенно при распространенных формах злокачественных опухолей. Очевидно, что одновременное удаление как популяции ОСК, так и опухолевых клеток (не-ОСК), может быть наиболее эффективной стратегией лечения [27].
Доклинические данные
о роли ОСК при РМЖ
Ответ на химиотерапию
Успешное изолирование ОСК РМЖ привело к исследованию их потенциального ответа на химиотерапевтические препараты, обычно используемые у пациентов. Несколько доклинических исследований свидетельствуют, что ОСК относительно устойчивы к противоопухолевым препаратам. Большинство из этих исследований были выполнены in vitro в изолированных клетках РМЖ или единичной клеточной взвеси, установленными при биопсии РМЖ или in vivo на моделях опухолей молочной железы.
Несколько исследований, проведенных на моделях РМЖ, продемонстрировали поддержание жизнедеятельности или значительное увеличение CD44+/ CD24низкий клеток после введения химиотерапии. Одно исследование продемонстрировало, что через 1 нед. после введения паклитаксела/эпирубицина при TM40D в мышиные клетки РМЖ подавляющее большинство клеток, сохранивших жизнедеятельность, экспрессировали фенотип ОСК CD44+/CD24низкий [35]. В связи с тем, что комбинация паклитаксела/эпирубицина наиболее часто используется в качестве первой линии лечения при РМЖ, поддержание жизнедеятельности ОСК, которые затем могут продолжать генерировать больше опухолевых клеток, может быть причиной рецидивов после лечения данными препаратами. Подобные результаты были получены в исследованиях, проведенных на биопсиях РМЖ [36, 37]. Также было определено увеличение самообновления и для молекулярного профиля клеток CD44+/CD24низкий, и для культур. Увеличение клеток, несущих данный генетический профиль, также наблюдалось после лечения с доцетакселом, что сопоставимо с выживаемостью ОСК [37].
Влияние ОСК на ответ на химиотерапию также было исследовано в контексте HER2-позитивного РМЖ. Выживание Sca1-позитивных клеток из опухоли, полученной из области HER2-позитивного РМЖ, было отмечено после лечения доксорубицином [38].
В клинической практике HER2-позитивный РМЖ связан с лучшим ответом на лечение антрациклинами [39], но выживаемость ОСК может быть причиной развития рецидива РМЖ после лечения. В недавнем исследовании HER2-опухоли молочной железы, экспрессирующие MC7-клетки, лечили с использованием трастузумаба и NK-клетки (natural killer), которая ответственна за так называемую антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), которая, как полагают, способствует терапевтическому эффекту трастузумаба [40]. Интересно, что лечение привело к избирательному выживанию клеток, которые имеют признаки ОСК-М. Все эти данные демонстрируют, что ОСК могут быть источником рецидива и прогрессирования HER2-позитивного РМЖ, потому что они могут возобновлять развитие опухоли после лечения, которое вызвало регрессию. Кроме того, было высказано предположение, что повторное введение трастузумаба может быть полезно при рецидиве опухоли; обновление клеточных культур демонстрирует аналогичную HER2-экспрессию и ADCC-предрасположенность. Это соответствует клинической действительности, поскольку повторное введение трастузумаба может быть оправданным при рецидиве в монорежиме или в комбинации с другими препаратами [41]. Резюмируя, необходимо отметить: было показано, что лапатиниб снижает процент CD44+/ CD24низкий клеток при использовании в качестве неоадъювантной терапии у пациентов с HER2-позитивным РМЖ, хотя и статистически незначимо [42]. Это возможно, поэтому предположили, что лапатиниб может быть использован для воздействия на ОСК в комбинации с химиотерапевтическими препаратами. Это могло бы объяснить противоопухолевую активность лапатиниба при введении в комбинации с капецитабином при метастатическом РМЖ [43].
Стоит отметить, что роль ОСК в случае химиорезистентности изучалась также при BRCA1-положительных опухолях молочной железы. При спонтанных BRCA1-положительных моделях опухолей молочной железы лечение цисплатином приводило к уменьшению размеров опухоли, но в дальнейшем наблюдалось возобновление роста [44]. Интересно, что опухолевые клетки, образовавшиеся от ОСК, были рефрактерны к платине, но также имели большую долю ОСК по сравнению с первичными опухолевыми клетками, которые были частично чувствительны к платине. Это говорит о модели химиорезистентности, где ОСК, которые устойчивы к платине, увеличивают свою пролиферативную активность. Хотя цисплатин не используется обычно в лечении РМЖ, это исследование демонстрирует, что клональная эволюция ОСК может способствовать устранению резистентности при BRCA1-положительных опухолях.
Последние данные показывают, что ОСК действуют как субпопуляция резистентных клеток, которые выживают на фоне химиотерапии и восстанавливают популяцию опухолевых клеток. Несколько версий могут объяснить химиорезистентность. Во-первых, стволовые клетки являются неактивно-делящимися клетками; они медленно пролиферируют в фазе G0 клеточного цикла и, следовательно, чувствительны к химиотерапевтическим препаратам, работающим в активных фазах клеточного цикла [8].
Кроме того, способствующим фактором может быть устойчивость к апоптозу из-за повышенной экспрессии антиапоптотических белков, таких как Bcl–2 [45]. К тому же, ОСК экспрессируют высокие уровни многофункциональных эфлюксных переносчиков с АТФ-связывающей кассеты семейства генов, которые, как известно, играют важную роль при множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. В частности, они экспрессируют транспортеры, кодирующие гены ABCG2 и ABCB1, которые составляют основу генов множественной лекарственной устойчивости [46]. Также необходимо отметить, что фермент ALDH, который является молекулярным маркером ОСК, способен метаболизировать химиотерапевтические препараты, такие как циклофосфамид, который широко используется в первой линии терапии РМЖ [47].
Стоит отметить, что среди всех исследований, изучающих роль ОСК при химиорезистентности РМЖ, есть одно исследование, демонстрирующее противоречивые результаты. Неожиданным образом статистически значимое снижение CD44+/CD24низкий клеток было продемонстрировано при РМЖ после неоадъювантного лечения с использованием режима эпирубицин/циклофосфамид [48]. Полученные данные вызывают сомнение относительно предполагаемой роли CD44+/ CD24низкий клеток как причины химиорезистентности. Интересно, что в другом исследовании, проведенном при биопсии РМЖ, увеличение популяции ALDH1-положительных клеток, но не CD44+/CD24низкий клеток, наблюдается после проведения неоадъювантной терапии паклитакселом и эпирубицином/циклофосфамидом/ фторурацилом [49]. В совокупности данные результаты ставят под сомнение роль молекулярных маркеров ОСК для идентификации ОСК при развитии химиорезистентности и подчеркивают необходимость дальнейших исследований.
Ответ на гормонотерапию
Появляется все больше данных, поддерживающих роль ОСК в развитии устойчивости к гормональной терапии при РМЖ. Недавно субпопуляции клеток рецепторов эстрогена (ER) -/ прогестерона (PR) -/ СD44+/СК5+, которые имеют свойства ОСК, были найдены в ER+/PR+ ксенотрансплантате РМЖ [50]. Интересно, что лечение с использованием тамоксифена или фулвестранта привело к селективному обогащению этих клеток, тогда как популяция ER+/PR+ клеток была снижена [51]. Эта субпопуляция ER-/PR-/СК5+ клеток, которая устойчива к гормональной терапии по причине отсутствия рецепторов, может играть важную роль при неблагоприятном исходе лечения ER+ РМЖ.
Похожие данные были опубликованы при опухолях молочной железы, которые характеризуются сильным повышением CD44+/CD24низкий после лечения летрозолом [37].
Ответ на лучевую терапию
Существует несколько исследований по оценке роли ОСК в ответе на лучевую терапию при РМЖ. В целом, эти исследования выполнены in vitro на клеточных линиях РМЖ и демонстрируют, что ОСК-М обладают повышенной резистентностью к лучевой терапии, демонстрируя накопление и устойчивость после проведения лучевой терапии [52–54]. Несколько механизмов могут быть ответственны за это явление.
В двух из этих исследований был показан значимо низкий уровень активных форм кислорода (АФК), которые наблюдались в маммосферах, а также клетках, полученных из человеческих и мышиных опухолей молочной железы [54, 55]. АФК создают несколько форм вредного воздействия на ДНК, такие как основное повреждение, одно- и двухцепочечный разрывы, которые могут быть причиной гибели клеток [56], таким образом, снижение уровней АФК может способствовать выживаемости ОСК после проведения лучевой терапии. Кроме того, было обнаружено, что ОСК избыточно экспрессируют гены, участвующие в метаболизме АФК [55]. Более того, другое исследование указывает, что увеличение выживаемости ОСК после облучения объясняется их пониженной склонностью подвергаться физиологическому старению из-за низкой экспрессии р21 и повышенной активности теломеразы [53]. Важно отметить, что увеличение способности к репарации ДНК может также способствовать радиорезистентности путем избирательной активации контрольной точки ответа на повреждение ДНК, такой как увеличение активации сигнального пути ATM-белка (ataxia telangiectasia mutated). Интересно, что направление ATM-активации путем блокирования преодолевает резистентность ОСК и приводит к терапевтической модели для эрадикации резистентности к лучевой терапии при РМЖ [57].
Было показано, что ОСК-М не только выживают после облучения, но также сохраняют способность к самообновлению в течение нескольких поколений, что определяется повышенной способностью к образованию сфер после проведения фракционной лучевой терапии [52]. Соответственно, опухоли молочной железы могут содержать долю онкогенных клеток (ОСК), которые вызывают обновление популяции опухолевых клеток во время перерывов в лучевой терапии и приводят к радиорезистентности.
Влияние ОСК на клинические
результаты лечения пациентов,
страдающих РМЖ
Ряд исследований свидетельствуют о возможной роли ОСК в резистентности к лечению РМЖ в силу их накопления после химиотерапии, лучевой терапии и гормонотерапии. Однако большинство из этих исследований не показали значимой корреляции между накоплением ОСК, прогнозом и клиническим результатом лечения пациентов, страдающих РМЖ.
Напротив, одно из последних исследований демонстрирует корреляцию процента ОСК с плохим клиническим ответом на химиотерапию и снижением общей выживаемости при РМЖ [58]. В частности, доля ОСК была определена (путем ALDH1 ферментативного анализа, исследования фенотипа CD44+/CD24низкий и анализа образования маммосфер) при РМЖ у людей путем выполнения биопсии опухоли до начала неоадъювантной химиотерапии. Интересно, что процент ОСК был выше при биопсии у пациентов, которые имели стабилизацию или прогрессирование заболевания, по сравнению с теми пациентами, у которых наблюдался полный или частичный ответ на лечение. Кроме того, ALDH1-экспрессия была ниже у пациентов, которые имели более высокую частоту ответов. В этом исследовании высказано предположение о том, что процент ОСК коррелирует с резистентностью к химиотерапии и что их количественная оценка может использоваться в качестве способа прогнозирования чувствительности к химиотерапии.
Ряд исследований также оценивает прогностическую значимость ОСК как молекулярного маркера при РМЖ. Прежде всего, несколько исследований оценивали влияние ALDH1-экспрессии на клинический результат лечения пациентов с РМЖ. Два исследования показали значимую корреляцию ALDH1-экспрессии при трижды отрицательных опухолях молочной железы с неблагоприятным клиническим параметром, таким как распространение в лимфатических узлах [59, 60]. В одном из двух исследований ALDH1-экспрессия также была ассоциирована с HER2-позитивным статусом [60]. В дополнение к этому, ALDH1-экспрессия продемонстрировала корреляцию с системным метастазированием и снижением выживаемости пациентов с отечно-инфильтративной формой РМЖ [61]. Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия молекулярных маркеров ОСК может коррелировать не только с более агрессивным течением болезни, но также и с известными подтипами РМЖ неблагоприятного прогноза.
CD44 представляет собой молекулу клеточной адгезии, которая вовлечена в процесс связывания клеток с гиалуроновой кислотой; показано, что бывает повышенная экспрессия как при раке in situ, так и при инвазивном РМЖ [62], и принимает участие в миграции и метастазировании опухолевых клеток [63]. Аналогичным образом было показано, что ALDH1, CD44+/CD24низкий фенотип ассоциирован с базальноподобной подгруппой опухолей молочной железы [64], а также и с BRCA1-опухолями [64, 65], предполагая, что это может свидетельствовать об агрессивном молекулярном подтипе. Недавно было продемонстрировано, что изоформы CD44 могут быть по-разному экспрессированы в отдельных подгруппах РМЖ, высказано предположение, что молекула CD44 может быть частью программы прогрессирования опухоли, которая приводит к развитию отдельных молекулярных подтипов [66]. Это наиболее важно, потому что оба молекулярных маркера ОСК – ALDH1 и фенотип CD44+/CD24низкий, по-видимому, коррелируют с молекулярными подтипами РМЖ с неблагоприятным прогнозом, роль ОСК в биологическом поведении агрессивных опухолей является областью активных исследований. Однако тот факт, что экспрессия двух маркеров ОСК не всегда совпадает в опухолях молочной железы [13, 60–61], может означать, что эти два различных маркера обозначают ОСК различного происхождения [66].
Терапия, направленная на ОСК
Предшествующие исследования показали, что ОСК-М составляют небольшие популяции клеток в опухоли, которые являются одновременно и устойчивыми к лекарственным препаратам, и источником нового роста опухоли. Теоретически, если эти клетки были удалены, то остальные клетки не смогли бы обеспечивать новый рост опухоли [42, 67]. Эта концепция привела к разработке различных потенциальных препаратов, в основном ориентированных на молекулярные пути обновления и регуляции ОСК, которые в соответствии с гипотезой ОСК вызывают неуправляемое образование опухоли [21]. Большинство исследований по-прежнему выполнены на доклиническом этапе, in vitro на клеточных линиях РМЖ или in vivo на мышиных моделях РМЖ.
Первой концепцией является воздействие на поверхностные маркеры ОСК. Примером такого подхода может быть воздействие на CD44 с помощью специфического антитела P245, что приводит к блокированию роста ксенотрансплантатов РМЖ человека [68]. Кроме того, лечение P245 ксенотрансплантатов базальноподобного РМЖ во время ремиссии опухоли снижает частоту рецидивов [68]. Аналогично, направленный на ALDH1 маркер ОСК с помощью специфических CD8+ Т–клеток удаляет число ОСК и блокирует рост и метастазирование в ксенотрансплантате иммунодефицитных мышей [69]. В своей совокупности эти данные свидетельствуют о том, что сочетание химиотерапевтических препаратов либо со специфическими антителами или с T-клеточной направленной иммунотерапией, которая избирательно воздействует на поверхностные маркеры ОСК, может иметь потенциальное преимущество.
Другой сигнальный путь, который является критическим для нормального развития молочной железы и обновления JCR, – Notch-путь [70]. Notch-рецепторы 1 и 4 связываются с различными лигандами, которые вызывают их расщепление ферментом γ-секретазой, что приводит к активации генов, участвующих в клеточной пролиферации [71]. В результате его функционального значения, а также из-за аберрантной экспрессии внутриклеточного домена Notch и при внутрипротоковом РМЖ in situ (DCIS), и при инвазивном внутрипротоковом раке [72] Notch сигнальный путь является одной из наиболее привлекательных потенциальных терапевтических мишеней. Ранее леченные культуры маммосфер, выделенные от образцов DCIS с помощью ингибитора Notch γ-секретазы (GSI) DAPT (N-[N-(3,5-difluorop­hen­acetyl)-1-alanyl]-S-phenylglycinet-butyl ester) или Notch-4 нейтрализующего антитела, показали снижение эффективности маммосфер [73]. Эти данные позволяют предположить, что Notch-ингибиторы могут быть использованы в качестве химиопрофилактики при DCIS в целях снижения прогрессирования заболевания.
Кроме того, направленность на Notch-путь при клеточных линиях РМЖ или моделях РМЖ привела к элиминации ОСК и эрадикации образования опухолей [74–77]. Были проанализированы многие методы блокирования Notch, такие как лечение с GSI [75], генетическое ингибирование (продукция малых РНК выключает гены клеточных линий) [75, 77] и иммунотерапия (цитотоксические лимфоциты против белков Notch) [74]. GSI в настоящее время проходят клинические исследования для лечения распространенного РМЖ. В недавней фазе I клинического исследования, которая включала 24 пациента с РМЖ, р.о. GSI МК-0752 был хорошо переносим в еженедельном режиме, но не было получено клинического улучшения у пациентов с РМЖ [78]. Интересно заметить, что одно исследование показало, что специфическая блокада Notch-4 с использованием малых РНК имеет больший эффект в снижении активности ОСК-М, чем GSI [75].
Кроме того, было показано, что Notch сигнальный путь активируется при гиперэкспрессии HER2 [79]. Специфическое блокирование Notch 1 снижает поверхностную экспрессию HER2-клеток и в результате приводит к снижению сферообразующей активности при ксенотрансплантатах РМЖ [79]. Более того, лечение моделей HER2-позитивного РМЖ с использованием GSI продемонстрировано, чтобы элиминировать ОСК [80]. На основании этих данных высказано предположение, что ингибирование Notch патологического пути может быть использовано как ОСК-направленная терапия, чтобы увеличить терапевтическую эффективность трастузумаба или лапатиниба при HER2-позитивных опухолях молочной железы. Одно их последних исследований продемонстрировало обнадеживающие результаты, указывающие на то, что комбинированное использование GSI MRK-003 и LY 411 575 и трастузумаба может снизить частоту рецидивов опухоли при трастузумаб-чувствительных ксенотрансплантатах РМЖ [81]. Противоречивые результаты были получены другими авторами: так, было показано, что Notch сигнальный путь играет важную роль при HER2-негативном РМЖ, в частности, антитело, блокирующее Notch-1, в результате приводит к сенсибилизации клеток РМЖ к лучевой терапии при HER2-негативных опухолях [82] .
Дополнительными сигнальными путями, которые, возможно, вовлечены в регуляцию при ОСК-М, являются фосфатидил-инозитол-3-киназа (PI3K) и Wnt сигнальные пути. В частности, PI3K/Akt/mammalian target of rapamycin (mTOR)/ сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции (STAT3)/ и PTEN образуют сложную сеть сигнального пути, что считается нарушением регуляции, а также служит в качестве модулятора лекарственной резистентности при РМЖ [83]. Было показано, что комбинированное ингибирование и PI3K ингибитором LY294002, и mTOR ингибитором рапамицина снижает боковую популяцию (активная популяция стволовых клеток) при клеточных линиях РМЖ и рост опухоли у мышей [25]. Кроме того, лечение с использованием Akt-ингибитора перифозина способствует уменьшению количества ОСК и роста опухоли при ксенотрансплантате РМЖ [84] и чувствительность ОСК к лучевой терапии при отсутствии p53 у мышей [85].
Помимо всего, появляется все больше доказательств нарушения регуляции Wnt при РМЖ у человека [86–88]. Недавно блокирование Wnt сигнального пути путем поступающего с пищей полифенола куркумина и пиперина показало снижение образования маммосфер и процента ALDH1-положительных клеток [89]. Наиболее важно, что эти препараты не влияли на дифференцированные клетки в данном исследовании, которое может быть причиной ограниченной токсичности на нормальные ткани и может способствовать введению этих препаратов в комбинации с химиотерапевтическими препаратами для повышения их эффективности. Однако эффект и безопасность данных препаратов у пациентов должны быть изучены в клинических исследованиях.
Как упоминалось ранее, одной из основных характерных особенностей ОСК является устойчивость к апоптозу. Высказано предположение, что антиапоптотические белки могут также играть важную роль в выживании ОСК. Недавно было показано, что генетическая супрессия антиапоптотического FLICE-Like ингибирующего белка (с-FLIP) с использованием мышиных специфических миРНК (siRNA) (FLIPi) избирательно и повторно воздействует на ОСК-М независимо от статуса гормональных рецепторов и чувствительности их к химиотерапевтическому препарату – фактору некроза опухоли связанный лиганд, индуцирующему апоптоз (TRAIL) [90] – противоопухолевый препарат, который, как было показано, имеет ограниченный терапевтический потенциал на клеточных линиях РМЖ [91]. Важно отметить, что было продемонстрировано отсутствие токсичности в отношении нормальных клеток и что возможно использование FLIPi/TRAIL без нежелательных явлений. В другом исследовании было показано, что активный мутантный проапоптотический ген BIK, названный BikDD, снижает ОСК-М на клеточных линиях РМЖ без токсического воздействия на нормальные клетки [92]. Кроме того, было установлено, что BikDD имеет взаимно-усиливающий эффект с лапатинибом при HER2-позитивных клетках и с паклитакселом – при HER2-негативных клетках [92]. Эти результаты показывают, что молекула BikDD может повысить терапевтическую эффективность и лапатиниба, и химиотерапии без серьезных побочных эффектов.
В заключение необходимо отметить, что некоторые препараты, применяемые при других заболеваниях, были изучены в доклинических исследованиях для оценки их потенциального воздействия на ОСК-М. Одним из наиболее перспективных препаратов является достаточно часто используемый противодиабетический препарат метформин, который показал селективное снижение ОСК на клеточных линиях РМЖ [93]. Удивительно, что комбинированное введение и метформина, и доксорубицина в клеточные культуры и ксенотрансплантаты приводит к эрадикации как ОСК, так и не-ОСК опухолевых клеток, тогда как лечение только доксорубицином не влияет на ОСК [93]. Кроме того, также было установлено, что метформин синергически взаимодействует с трастузумабом, чтобы уменьшить образование маммосфер и их размер при трастузумаб-резистентных HER2-положительных опухолях [94]. Поэтому заманчиво выглядит предположение, что лечение с одновременным использованием метформина и химиотерапевтических препаратов или анти-HER2 таргетной терапии может принести значительную пользу и уменьшить опухоль.
Среди других препаратов было показано, что антинеопластический препарат циклофосфамид продемонстрировал анти-ОСК активность при ксенотрансплантате РМЖ [95]. Это звучит как парадокс, но экспрессия ALDH1, особенно ОСК, может нейтрализовать активные метаболиты циклофосфамида [96]. Тем не менее, это расхождение данных можно объяснить тем, что большинство прямых данных демонстрируют это в контексте переноса генов ALDH1, что приводит к повышенной экспрессии [97]. В этом исследовании эндогенные уровни ALDH1 могут быть недостаточными для придания устойчивости ОСК на клеточном уровне в клинически значимых дозах; другие механизмы, возможно, связаны с увеличением репарации ДНК, индуцированной циклофосфамидом, и могут быть вовлечены в чувствительность ОСК [95]. Кроме того, сообщалось, что салиномицин – антибактериальный ионофор калия, резко снижает процент ОСК на клеточных линиях и блокирует рост опухоли у мышей [98]. По сравнению с паклитакселом, который обычно используется при РМЖ, он вызывает снижение ОСК в 100 раз, что подразумевает, что комбинация этих двух препаратов может быть потенциальной терапевтической задачей [98]. Аналогичным образом была продемонстрирована селективная эрадикация ОСК-М с фумаратом – ингибитором гена ABCG2, экспрессирующим ABC-T транспортеры [99].
Заключение
Концепция ОСК имеет важное значение не только для нашего понимания канцерогенеза, но и для развития терапии опухолей. Существует все больше доклинических доказательств того, что опухолевые стволовые клетки способствуют развитию резистентности к химиотерапии и лучевой терапии. Тем не менее, на сегодняшний день значительного влияния на клинический исход болезни выявлено не было. Разработка более эффективных методов лечения для преодоления терапевтической резистентности может включать также одновременное воздействие и на ОСК. Данные доклинических исследований, которые опубликованы на сегодняшний день, являются перспективными, но они до сих пор не были переведены в клинику в полном объеме, потому что клиническая эффективность препарата-кандидата для таргетного воздействия на ОСК должна быть еще подтверждена в клинических исследованиях. Использование препаратов, которые взаимно влияют на самообновление стволовых клеток, представляет новую стратегию выбора, но также и большую проблему, потому что многие пути имеют долю опухолевых стволовых клеток и их нормальных аналогов. Кроме того, регуляция путей ОСК тесно взаимосвязана, что позволяет предположить, что использование комбинации таргетных препаратов может быть необходимым для эффективного устранения этой клеточной популяции. Также необходимо учитывать новые стратегии в роли микроокружения, которое может изменить ответ на терапевтических мишенях.
Среди препаратов, которые исследованы в настоящее время, метформин и салиномицин, выборочно ингибируют ОСК и показывают значительную анти-ОСК активность. В частности, метформин является хорошо изученным препаратом, обычно используемым при лечении сахарного диабета, который отображает безопасный профиль токсичности и может быть использован в клинических исследованиях. Важно отметить, что некоторая ОСК-направленная терапия не оказывает влияния на нормальные дифференцированные клетки [89, 90, 92] и может быть легко использована в клинической практике в сочетании с химиотерапевтическими препаратами из-за ограниченной токсичности. Кроме того, некоторая таргетная терапия продемонстрировала синергическое взаимодействие с химиотерапевтическими препаратами, молекулярной таргетной или лучевой терапией [79, 85, 90, 92, 94], что увеличивает возможность комбинирования этих различных препаратов с целью увеличения эффективности лечения. Также HER2 выступает в качестве важного регулятора ОСК-М. Недавние исследования показали, что исключительная клиническая эффективность HER2 таргетных препаратов может быть связана с возможностью ориентироваться на ОСК-М. Дальнейшие исследования необходимы для улучшения понимания роли ОСК при РМЖ и расширения знаний о возможной терапии, направленной на ОСК, для помощи пациентам, страдающим РМЖ.

Читайте также:  Особенности заболевания при раке молочной железы

источник

Концепция раковой стволовой клетки в свете теорий видообразования рака и теорий мутагенеза в канцерогенезе опухолей

Согласно другой, более популярной в настоящее время теории раковой стволовой клетки, для формирования опухоли необходимы делящиеся, недифференцированные клетки, изначально представленные тканевыми (камбиальными) стволовыми клетками. Раковые ( опухолевые) же стволовые клетки представляют собой промежуточную ступень между здоровыми стволовыми клетками и измененными опухолевыми. Этот факт был установлен еще в 1971 году. A.Hamburger и S.Salmon в статье “Primary bioassay of human tumor stem cells” опубликованной в журнале “Scince” (1977) представили первые результаты выделения опухолевых стволовых клеток из карцином человека методом культивирования в полужидком агаре.

Исследователи получили три популяции опухолевых клеток , различающиеся по пролиферативным потенциям и вероятно, по своему значению для развития опухолевого процесса и исхода лечения:

1. «минорную» популяцию стволовых (клоногенных) клеток с неограниченным пролиферативным потенциалом, образующих в полужидком агаре колонии, содекржащие более 50 (т.е. 25 ) клеток;

2. субклоногенные (коммитированные) опухолевые клетки с ограничеснным пролиферативным потенциалом, образующие в полужидком агаре кластеры, содержащие менее 50 (т.е. CD45-c-kit+Sca-1-Lin+ => CD45+c-kit+Sca-1+Lin+, в результате чего клетки становятся раковыми. Пролиферативная активность пРСК контролируется piwil2, специфическим для мужских половых органов геном, расположенном у мышей на аутосомной хромосоме семейства PIWI/AGO.

Как мы уже отмечали ранее, о существовании РСК впервые заговорили в контексте острой миелоидной лейкемии (ОМЛ). Одновременно они были идентифицированы и в злокачественных образованиях груди и центральной нервной системы (ЦНС). Теория раковых стволовых клеток гласит о том, что РСК – это клетки, инициирующие рак и составляющие в опухоли отдельную клеточную популяцию. Они обладают типичными для стволовых клеток свойствами, прежде всего, способностью самообновляться и дифференцироваться в клетки разных типов. Для пролиферации и дифференциации они могут пользоваться теми же путями, что и обычные стволовые клетки, в частности сигнальными путями Notch- или sonic hedgehog (SHH)/Wnt. Идентифицировать и обогатить стволовые клетки в глиоме можно по экспрессии CD133, белка клеточной поверхности 120 kDa, который также является маркером нервных стволовых клеток человека (Vescovi A.L., Galli R., Reynolds B.A. 2006).

Еще один вопрос заключается в том, почему клетки- предшественники с одной стороны являются причиной развития опухоли как РСК, а с другой стороны — вообще действуют против опухоли? Как упоминалось выше, нервные предшественники – это, скорее всего, именно те клетки, из которых вырастают опухоли головного мозга. Учитывая, что пролиферирующая клетка всегда представляет собой хорошую мишень для мутаций и трансформаций, хотелось бы, чтобы у животного и человека был механизм защиты. Похоже, что противоопухолевый эффект, который наблюдали многие ученые, это механизм, с помощью которого клетка-предшественник спасает себя в том случае, если другая клетка уже имеет анеуплоидию и есть риск развития опухоли.

Сегодня установлено, что нейрогенез во взрослом мозге с возрастом ослабевает (Kempermann G., 2006) и нейрогенез, то есть делящиеся НКП, являются медиаторами противоопухолевого эффекта. Таким образом, снабженные большим количеством НКП молодые животные при глиобластоме выживают дольше, чем более старшие. Если нейрогенез настолько положительно влияет на головной мозг, то почему же с возрастом он ослабевает и делает старых животных более подверженными риску возникновения глиобластомы? Вероятно, это объясняется тем, что на ранней стадии развития необходима пластичность клеток, обеспечиваемая большим депо клеток-предшественников. Эти предшественники считаются наиболее вероятными корнями опухолей головного мозга, поэтому увеличение количества НКП одновременно повышает шансы, что одна из этих клеток мутирует и в результате образуется глиома. Скорее всего, нейрогенез со временем уменьшается, когда клеточная пластичность в такой мере больше не нужна. Уменьшение количества пролиферирующих НКП должно снизить риск того, что эти делящиеся клетки, в конце концов, трансформируются (с возрастом вероятность этого увеличивается) и приведут к формированию опухоли. Тем не менее, вследствие ослабления нейрогенеза оказывается, что в тот момент, когда появляется опухоль, противоопухолевый эффект собственных клеток-предшественников уже не работает.

Несомненно, новый методологический подход к оценке канцерогенеза как форме видообразования, предложенный P. Duesberg et al., 2011 представляется достаточно аргументированным и обоснованным, как его собственными исследованиями кариотипов и кариограмм различных опухолей, так и экспериментальными работами его коллег с которыми он проводил фундаментальные кооперативные исследования. Критика P. Duesberg et al., 2011 классической мутационной теории канцерогенеза очень точна, теоретически строга и экспериментально обоснованна. Теория видообразования объясняет почти все парадоксы конкурирующей теории мутации, на которой построена вся современная онкология и существенно дополняет и объясняет пути формаировани РСК в теории раковых стволовых клеток. Она отвечает на вопрос: являются ли раки «специфическими» хромосомными мутациями? Ответ на этот вопрос имеет определенную историю. Предположив «единую причину злокачественных опухолей», Teodor Boveri предположил еще в 1914 году, что «специфические» увеличения количества хромосом или их уменьшения являются причинами рака. Но когда в 1950-е появились технологии для проверки теории Boveri, во всех протестированных раках были выявлены не «специфические анеусомии», а индивидуальные кариотипы. В результате теория Boveri была забыта в пользу превалирующей ныне теории, что 3-6 «специфических мутаций» приводят к раку.

При этом новая теория видообразования прогнозирует индивидуальные кариотипы, которые были выявлены во всех раках. Соответственно, «единой причиной» рака должно быть видообразование. Boveri также предполагал, согласно своей теории, что канцерогенез «может быть достигнут потерей одиночной хромосомы». Соответственно, он приступил к индуцированию рака в роговице кролика, вызвав нерасхождение хромосом. Для этого, он индуцировал тетраплоидию ингибиторами митоза, которые затем будут благоприятствовать потере или приобретению хромосом при помощи нерасхождения в последующих митозах. Но у его животных «спустя некоторое время» опухоли не появились. Согласно прогнозу теории видообразования, однако, времени было предоставлено недостаточно и соответствующие клетки в эксперименте T.Boveri, возможно, были обработаны недостаточной дозой канцерогена для эволюции нового автономного кариотипа рака. Действительно, в течение года после публикации Boveri своей классической работы, Yamagiwa и Yoshikawa продемонстрировали в 1915 году зависимость канцерогенеза, вызванного гудроном (канцероген), у кроликов, от латентных периодов более одного года, и от обработки гудроном перспективной ткани от 2 до 3 дней в неделю в течение одного года.

Очень важное положение, установленное P. Duesberg et al., 2011 является доказанное утверждение, что анеуплоидия ингибирует рак. Со времени открытия Т.Boveri индивидуальности хромосом, известно, что анеуплоидия обычно ингибирует и нарушает рост и развитие не раковых клеток и организмов. Недавно побочные эффекты анеуплоидии на нормальный рост и развитие нераковых клеток и организмов были дополнительно изучены и распространены на генетически инженерных животных.

Поскольку анеуплоидия нарушает нормальный рост и развитие, но встречается повсеместно при раке. Ряд исследователей недавно пришли к выводу, что анеуплоидия должна быть несовместима с раком, если ее отрицательное воздействие не накапливается мутациями, выдерживающими анеуплоидию. Анеуплоидия у рака, таким образом, была названа «парадоксом» , и даже «фатальным недостатком рака». Соответственно, было выдвинуто предположение, что «идентификация генетических изменений, позволяющая клеткам выдерживать анеуплоидию… предоставит значимые факты относительно эволюции опухоли». Эта точка зрения, таким образом, предполагает, что «анеуплоидия» раков эквивалента анеуплоидии нераковых клеток.

Но если «анеуплоидия» раков на самом деле является кариотипами новых автономных видов рака в виде РСК нового вида, парадокс будет решен. Как самостоятельный вид, рак является не более анеуплоидным, в сравнении с нормальным видом, от которого он развился, чем один вид при сравнении с другим.

Не менее важным и фундаментальным отличием теории видообразования рака от теории мутагенеза рака является анализ возрастных отклонений рака, из-за постнатальных мутаций? В журнале “Cancer Science and Society», Rob A. Cairns представляет возрастные отклонения рака как малоизвестную характеристику исследований рака (как и другие авторы): «В целом объективно не слишком осознается, как резко вырастает с возрастом заболеваемость раком. Возьмем типичный пример, смертность от рака толстого кишечника возрастает более чем в тысячу раз в возрасте от 30 до 80». В связи с этим P. Duesberg et al., 2011 показывают на диаграммах экспоненциальный рост заболеваемости раком с возрастом у американских мужчин в 2001 по данным Реестра рака Национальной программы США. Это очень иллюстративно и достаточно наглядно. В то же время с возрастом нарастает количество мутаций в СК и соответственно количество РСК значимо увеличивается.

Чтобы согласовать экспоненциальный рост заболеваемости рака с возрастом, теория мутации утверждает, что «намеренно неопределенное» количество от 3 до 6 специфических мутаций необходимо для канцерогенеза. Поскольку заболеваемость раком у новорожденных статистически незначительна, теория мутаций предполагает, что у новорожденных нет таких мутаций, и эти мутации должны приобретаться после рождения. Это предположение, однако, не поддерживается теорией мутаций. Наоборот, теория мутаций постулирует, что наследуемые наборы мутировавших онкогенов, таких как наследуемые гены ретинобластомы, нефромы, аденоматозного полипоза толстой кишки, ксеродермы пигментной, не являются достаточными для развития рака. Более того, экспериментальные данные показали, что мутировавшие онкогены могут быть стабильно интегрированы в зародышевую линию различных линий мышей, именуемых трансгенными онкомышами.

Теория мутаций, таким образом, прогнозирует, что наборы онкогенов должны накапливаться в зародышевой линии, и что наследование комплементарных наборов онкогенов должно генерировать раки груди, кишечника или легких у новорожденных людей или животных. Но это ни разу не было описано в литературе. Отсутствие раков у новорожденных является, таким образом, парадоксом с точки зрения теории мутации.

При этом теория видообразования опухолей точно прогнозирует возрастные отклонения рака: поскольку врожденные анеуплоидии обычно летальные, теория видообразования прогнозирует нормальные кариотипы при рождении, и, соответственно, отсутствие рака у новорожденных. По образному выражению P. Duesberg et al., 2011, «часы канцерогенеза установлены на ноль у новорожденных». Возрастные отклонения рака, соответственно, являются предсказуемым следствием времени, в ходе которого 1) медленные накопления спонтанных анеуплоидий, и 2) последующая очень редкая и, соответственно, очень медленная эволюция автономного ракового кариотипа приводят к раку в пожилом возрасте.

P. Duesberg et al., 2011 пришли к заключению, что видообразование и формирование РСК является «единой причиной» рака и с ними трудно не согласиться. Природа использует два альтернативных механизма для производства новых фенотипов : 1) мутация специфических генов, которые сохраняют базовый кариотип, и тем самым, вид, и 2) видообразование путем ремоделирования кариотипа в целом, обычно сохраняя гены предшественника. Принимая во внимание эти потенциальные альтернативы для конвертирования нормальной клетки в раковую клетку, теория мутации приписывает канцерогенез мутации специфических генов, тогда как теория видообразования приписывает канцерогенез генерированию новых автономных кариотипов. Итак, как мы можем определиться, является ли «единой причиной» рака (5,167) мутация или видообразование?

P.Duesberg et al., 2011 попытались ответить на этот вопрос путем сравнения возможностей объяснения общих характеристик раков двумя конкурирующими теориями. Это сравнение показало, что теория видообразования способна объяснить все пять общих характеристик раков, автономию, индивидуальность, гибкость, бессмертность и длительные латентные периоды от канцерогена до рака. При этом способность теории мутаций объяснить пять общих характеристик рака по прежнему неочевидна по ряду причин: 1) при нехватке функционального доказательства онкогенных мутаций, теория по-прежнему неуверенна относительно природы и точного числа мутаций, необходимых для трансформации нормальной клетки в раковую. Вместо этого, обычно предлагаются примерные оценки в «3-6» мутаций . Но недавнее «секвентирование генетических изменений в разных рака показало, то, чего опасались многие (sic) на самом деде существует» –это еще более индивидуальные мутации. 2) Теория не идентифицирует мутации, которые определяют комплексные морфологические и физиологические индивидуальности раков, например, индивидуальные фенотипы более 57000 раков человека с индивидуальными кариотипами, перечисленными в базе данных NCI-Mitelman. 3) Теория мутаций не предлагает объяснения необычайного совпадения того, что каждый рак возникает не только со специфической мутацией, но также с индивидуальным кариотипом, который будет стабильным и таким образом, клональным в течение тысяч поколений.

Читайте также:  Медицинское название рака молочной железы

В целом P. Duesberg et al., 2011 приходят к заключению, что единой причиной рака является видообразование, и что теория видообразования объясняет, почему раки являются автономными, обладают индивидуальными кариотипами и комплексными индивидуальными (а не единичными) фенотипами, являются гибкими, и при этом бессмертными, и почему даже наиболее мощным канцерогенам требуется от нескольких месяцев до десятилетий для того, чтобы привести к раку.

Но если теория мутагенеза терпит полное фиаско, то как уложить в прокрустово ложе теории видообразования рака ультрасовременную концепцию раковых стволовых клеток. Ведь именно она, сегодня, во многом объясняет фундаментальные механизм формирования различных типов опухолей из специализированной регионарной стволовой клетки, которая, по современным канонам, трансформируется в результате мутагенеза в раковую стволовую клетку (РСК). Быть может , надо по- новому, посмотреть и на эту теоретическую концепцию возникновения рака и других злокачественных опухолей. Подробное описание современной концепции РСК и ее значение для онкологии читатель сможет найти в нашей предущей монографии ( А.С.Брюховецкий « Клеточные технологии в нейроонкологии: циторегуляторная терапия глиальных опухолей головного мозга», 2011). Здесь же мы очень кратко осветим некоторые положения этой научной теории и попытаемся соединить ее представления с новой идеологией канцерогенеза как формы видообразования.

Итак, данные проведенных многочисленных международных исследований свидетельствуют о том, что подавляющее большинство раковых образований являются клонами, а раковые клетки в них представляют собой потомство одной клетки . Последние данные свидетельствуют о том, что этот процесс запускают раковые стволовые клетки (РСК). Собственно это фундаментальное положение теории и стало краеугольным камнем всего теоретического построения предложенной теоретической концепции РСК. При этом, РСК были идентифицированы в гематопоэтических и солидных опухолях, однако механизм деривации РСК практически не изучен. По-видимому, анеуплодия является также основным механизмом формирования из нормальных стволовых клеток РСК. Возможно, РСК происходят из стволовой или прогениторной клетки, проходя при этом предраковую стадию, во время которой под действием окружающей среды отходят от своей генетически заложенной программы самообновления и смещаются в иерархии клеток, а прогениторные клетки могут приобрести свойства стволовых. Такие клетки в современной научной литературе определяются, как предраковые стволовые клетки (пРСК). Если внимательно присмотреться к теории видообразования, то в ней также существует этап формирования или «генерирования» по P. Duesberg et al., 2011 пренеопластического кариотипа соматической клетки за счет анеуплоидий.

Классическая концепция РСК однозначно утверждала, что формирование РСК происходит из нормальной стволовой клетки за счет мутаций в ней, обусловленных воздействием различных канцерогенов. Теория видообразования рака предполагает возможность формирования РСК как из нормальной (нейральной, гемопоэтической, мезенхимальной и т.д.) СК, так и из уже дифференцированной взрослой соматической клетки (нервной, нейроглиальной, печеночной, легочной и т.д). За счет постепеннного накопления анеуподий в СК или во взрослой дифференцированной клетке, вследствие чего эта соматическая клетка приобретает неустойчивость кариотипа. Одним из природных механизмов обретения устойчивости кариотипа соматической клетки является ее деление. За счет митоза соматическая клетка пытается автоматически сохранить целостность своего видового генома, и обеспечить свое выживание , а клетки-потомки получившие после митоза нарушениея его структуры в виде анеуплодии становятся в основном не жизнеспособны и погибают. Если этот процесс автоматической стабилизации кариотипа нарушенного анеуплоидией идет в региональной (камбиальной) СК, то результатом митоза может быть несколько вариантов сценария саморегуляции этого процесса, которые зависят от формы митоза СК. Поскольку существует два варианта деления СК , то деление может быть симметричным или ассиметричным. При ассиметричной форме деления (СК делится на СК и клетку-предшественник) СК может сохранить свой видовой геном неизменным, а все явления анеуплодии останутся в геноме ее потомков в виде клетки- предшественника 1 поколения ( нулесомия, анеуплодия и т.д.). Как правило, такой сценарий оптимален для самосохранения СК как родоначальницы и хранителя видового кариотипа, а ее клетка -потомок не жизнеспособна и погибают путем апоптоза. 2. При симметричном делении СК ( СК делится на 2 равнозначные СК) с анеуплодиями имеется вариант того, что одна из СК сохранит свой кариотип неизменным, а другая СК будет содержать компоненты анеуплодии. Последняя СК продолжает оставаться неустойчивой и в ней запускается новый процесс митоза, как компенсаторный процесс регуляции неустойчивости генома, который будет продолжаться длительное время, абсолютно независимо от других внутритканевых процессов. Пока эти СК-потомки имеют различную степень анеуплодии они в большинстве своем мало жизнеспособны, но в результате механизмов автономии , хорошо обоснованной в теории видообразования рака, вполне высока вероятность формирования нового индивидуального неопластического кариотипа и эта клетка обретает устойчивость становясь РСК. При этом следует помнить, .что РСК это уже устойчивый кариотип 3. Существует еще один из вариантов сценария исходов деления нормальной СК с наличием анеуплодий, когда оба потомка СК после деления имеют в своем кариотипе эти различные формы анеуплодий. Естественные исходы этого процесса практически ничем не отличаются от исходов клетки с анеуплодией во втором сценарии, только процессы нестабильности генома в этом случае будут отмечены в обоих потомках СК с наличием анеуплодий.

Но самое важное, что впервые объясняет теория видообразования рака, это реальная возможность формирования РСК из высокодифференцированных взрослых специализированных клеток. Анеуплодия, возникшая в дифференцированной клетке, в результате воздействия канцерогена приводит к нестабильности и неустойчивости кариотипа клетки, в которой она возникла. В результате в высокодифференцированной специализированной клетке для устранения анеуплоидии должна бы запускаться стандартная программа клеточного цикла, исходом которой должен был бы быть митоз. Однако, дифференцированная клетка не может решить проблему неустойчивости генома стандартным путем митоза, так как она функционально связана с клеточным микроокружением ( множественные синаптические контакты у нервной клетки клетками нейроглии и нейронами микроокружения, взаимодействие клеток печени с клетками внеклеточного матрикса печеночной стромы и т.д.). Что-бы осуществить митоз, возможно компенсирующий нестабильность ее кариотипа, клетке с анеуплоидией необходимо нарушить свои длительно существующие функциональные связи с микроокружением в ткани и органе, отказаться от выполнения своих специализированных аффекторных функций. Дезинтеграция функциональных межклеточных взаимодействий и связей требует длительного времени. Клетка с измененным кариотипом должна приобрести черты стволовости и только после этого она сможет вступить в метафазу. Именно, поэтому приобретение признаков стволовости дифференцированной клеткой с анеуплоидией представляется не чем то сверх естественным , как это трактовала мутационная теория, а естественным и закономерным явлением, саногенетически обоснованным клеточным процессом. Становятся понятными и очевидными цели приобретения признаков стволовости дифференцированной клеткой. Это достаточно простой механизм разрушения межклеточных взаимосвязей и приобретения автономности клетки путем «ошаривания» мембраны дифференцированной взрослой клетки. Приобретение стволовости является закономерным этапом подготовки дифференцированной клетки к митозу для коррекции генетической неустойчивости. Поэтому теория видообразования раков в противовес теории мутации отвечает на другой вопрос онкологии однозначно : РСК могут образовываться как из нормальных СК, так и их высоко дифференцированных взрослых соматических клеток.

Возникает резонный вопрос, каким образом анеуплоидия дестабилизирует кариотип? Ответ на этот вопрос может быть достаточно простым, но в то же время достаточно неоднозначным. Хорошо известно, что например, гемопоэтические СК (ГСК) находятся большую часть времени своей жизни в Gо состоянии клеточного цикла , т.е в крайне устойчивом состоянии кариотипа. Именно поэтому из общей массы клеток, взятых при сборе ГСК только 8% их количества находится на различных стадиях клеточного цикла. ГСК человека вступают в обычной жизни в клеточный цикл достаточно редко — один раз в 1-2 года . Дифференцированная специализированная клетка также находится в устойчивом Gо – состоянии и ее кариотип постоянно находится в состоянии балансировки между проапототическими и промитотическими влияниями. Поэтому появление анеуплодии в клетке находящейся в Gо состоянии является основной причиной возникновения нестабильности ее кариотипа и запуска клеточного цикла как базового механизма восстановления видового кариотипного баланса ядра. Соматическая клетка ( СК и дифференцированная взрослая клетка ) реагируют стандартным внутриклеточным механизмом управления нестабильностью кариотипа в виде генерации митоза, поэтому любая соматическая клетка может стать источником генерации РСК.

Не ясно, однако, какие именно клетки выполняют функцию, вызывающих опухоль. Как распознать РСК. Манифестацией различных раковых заболеваний может быть гиперплазия и дисплазия на обратимой предопухолевой стадии, которые могут развиться в первичные и инвазивные опухоли. Так в первоисточниках концепции определены сами РСК и пРСК. Как мы видим, эти положения абсолютно не противоречат теории видообразования рака.

Теория мутагенеза ставила ключевые вопросы биологии опухолей следующие: действительно ли существуют РСК, как первопричина и основной источник образования опухолей? Формируются ли РСК из здоровых стволовых клеток или образуются из мутирующих дифференцированных соматических клеток? Существуют ли предраковые стволовые клетки (пРСК) и какие метаморфозы претерпевают родоначальные стволовые клетки, когда развиваются в пРСК и РСК? Почему другие СК, т.е аутологичные гемопоэтические и мезенхимальные СК костного мозга, выполняющие системные функции, не способны распознать опухолевые клетки и РСК в других органах и тканях (например патологические нейральные СК) и уничтожить их? Почему раковые клетки и РКС обладают определенной элитарностью приводят к гибели организма пациента?

На все эти вопросы теория видообразования практически сразу дала исчерпывающие ответы. Это происходит именно потому, что РСК и их потомки это переходные формы неустойчивых состояний кариотипа клетки с анеуплоидией и именно они определяют весь долгий путь от состояния устойчивости нормальной СК или дифференцированной соматической клетки, находящейся в стабильном GO состоянии клеточного цикла к устойчивому состоянию генома нового вида неопластической клетки, который также находится в Gо состоянии. Формирование РСК с дифференцированных нервных клеток, а также с нейральных низкодифференцированных клеток предшественников (НКП) сегодня также доказан и экспериментально подтвержден (Von Joo-Hee Walzlein , 2007).

В 1963 г. W.R. Bruce и H.Van der Gaag показали, что только часть клеток лимфомы in vivo может пролиферировать. Это позволяет предположить, что у опухолевых клеток тоже есть своя иерархия. Тот факт, что за рост и пролиферацию опухолей отвечает лишь небольшая группа клеток, так называемых «раковых стволовых клеток» (РСК), был подтвержден не только на гемопоэтических злокачественных опухолях, но и на опухолях солидных органов, в том числе новообразованиях груди, простаты, поджелудочной железы и толстой кишки. Специфической особенностью раковых стволовых клеток является то, что они поддерживают другие раковые клетки за счет постоянной дифференциации и самообновления.

Иерархия стволовых клеток начинается с наиболее примитивных и мультипотентных стволовых клеток. По мере перехода к верхним ступеням иерархии клетки становятся все более дифференцированными и, в конце концов, определяется их принадлежность к той или иной клеточной линии. Потенциал прогениторной клетки уже ограничен, ограничены ее возможность самообновляться, она производит прогениторные клетки только определенных линий, в итоге дифференцирующиеся в нейроны или клетки глии (Gage F.H. 2000).

Обобщая известные литературные факты о роли аутологичных СК в развитии опухоли у человека и млекопитающихся и опираясь на собственные теоретические представления и экспериментальные данные, складывается впечатление о том, что в канцегенезе опухоли собственные СК занимают самое центральное место. Во- первых, собственные регионарные камбиальные взрослые СК под воздействием различных патопластических канцерогенных этиопатогенетических факторов могут стать (вследствии анеупоидии и нестабильности кариотипа) РСК и запустить неуправляемый неопластический процесс в ткани. Во-вторых, аутологичные здоровые СК перестают распознавать РСК и их потомков как патологические и чужеродные клеточные системы, способные привести организм к гибели и являются основным фактором развития центровых специфических канцерогенных патологических клеточных процессов (неоангиогенеза, пролиферации, миграции, неонейрогенеза) в тканях и органах пациента. Можно предположить, что если после циторедукционного (хирургического), цитостатического и цитостатического (химиотерапевтического или лучевого) воздействия на опухоль останется хотя бы одна паранеоплатическая клетка с анеуполоидией ( даже не стволовая), то именно собственные стволовые клетки циркулирующие в крови и мигрирующие по тканям активируют ее, выполнят роль индуктора ее дедифференцировки в РСК и запустят новый онкологический процесс. Получается достаточно парадоксальный теоретический вывод о том, что собственные стволовые клетки даже теоретически не способны справиться со злокачественным паранеопластическим процессом в ткани при злокачественном онкологическом заболевании, они создают «благоприятные» условия для ее выживания в организме путем выработки факторов роста и нейротрофических факторов, а при наличии «благоприятных» условий в ткани для отдельных опухолевых клеток в организме рекрутирование, мобилизация и (или) введение из вне собственных СК может способствовать рецидиву , генерализации и активации неопластического процесса.

Было предложено две модели, которые могли бы объяснить, каким образом изменение одной клетки приводят к развитию раковой опухоли. Это вероятностная и иерархическая модели. Согласно первой, все клетки опухоли обладают одинаковым онкогенным потенциалом. Вторая же гласит, что среди всех этих клеток лишь небольшое подмножество, а именно, раковые стволовые клетки, способны порождать новые опухоли. Полиморфная глиобластома, как явствует из названия, как никакая другая опухоль, гетерогенна и содержит клетки самых разных типов. Логично предположить, что клетка, из которой произошли все эти клетки, обладала способностью порождать клетки разных типов, то есть являлась стволовой (Vescovi A.L., Galli R., Reynolds B.A. 2006).

Одна из многочисленных теорий о происхождении раковых стволовых клеток утверждает, что трансдифференциация стволовых клеток из здоровых в опухолевые происходит благодаря клеточной фузии между здоровыми и дифференцированными клетками. Именно фузией, по мнению отдельных исследователей, может объясняться также клеточная анеуплоидия и неоднородность раковых опухолей (Bjerkvig R. et al. 2005). К вопросу о клеточной фузии мы вернемся позже при обсуждении информационной концепции происхождения рака и попытаемся ответить на основные вопросы вопросы поставленные в этой подглаве.

Обобщая все вышеизложенные данные теоретических и экспериментальных исследований канцерогенеза рака, следует признать, что в свете концепции РСК причиной его возникновения, наиболее вероятно, является именно феномен видообразования, представленный в теории P. Duesberg et al., 2011. Мутационная теория рака пока не позволила решить фундаментальные вопросы терапии опухолей и в этой связи, нужно попытаться рассмотреть возможности использования теории видообразования в канцерогенеза рака для создания новых инновационных терапий опухолей.

Такой взгляд на вещи может сильно изменить подход к терапии онкологических заболеваний. Ведь в действительности очень и очень немногие лекарственные препараты, разработанные на основе концепции рака как следствия нескольких точечных мутаций, принесли хоть какую-то пользу. Впрочем, мощь научно-фармакологической индустрии, неустанно производящей подобные лекарства, такова, что вряд ли можно надеяться на скорое «изменение парадигмы». ( К. Стасевич ,2011)

Сопоставляя «теорию видообразования в происхождении рака», предложенную P. Duesberg et al., (2011) и описанную выше «теорию раковых стволовых клеток » становится очевидным, что они интегрирует все современные достижения и представления о генезе рака и других опухолей. Они позволяет ответить на целый ряд противоречий и «не стыковок» существующих в современной онкологии. Системность и физиологичность проведенных исследований, стройность и последовательность изложений авторов хорошо укладываются в современные биологические представления эволюционной теории. Доказательность и аргументированность научных фактов и достаточная иллюстративность представленных кариотипов с видовой неопластической трансформацией, например в работе Duesberg et al. (2011) не вызывают сомнения с позиций фундаментальной науки. Однако, выводы и формулировки теории видообразования рака верны преимущественно с теоретических и системных позиций современной биологии. С позиций современной медицины и существующих представлений врача – клинициста (онколога, нейрохирурга, гинеколога и т.д.), предложенная теория видообразования рака это методологический тупик в разработке и создании новых терапий рака. Это связано с рядом фундаментальных выводов данного методологического подхода сделанных исследователями. Например, теория видообразования рака утверждает, что «канцерогенез это длительное и постепеннное формирование нового вида клеток». В соответствии с этим утверждением, только тогда, когда этот процесс будет полностью завершен и новый вид соматических клеток будет полностью сформирован, завершатся пролиферативные процессы неуправляемого митоза ОК и изменененный канцерогенами кариотип клетки с анеуплоидиями обретет стабильность и устойчивость в форме нового вида ( устойчивой линии клеток). То есть, из этого положения следует, что до естественного завершения процесса видообразования пренеопластического кариотипа в неопластический кариотип линии раковых клеток любые терапевтические усилия будут не эффективны. Более того, любая терапия опухоли еще больше усилит нестабильность генома и неопластическую трансформацию ее кариотипа, чем увеличивает лекарственную резистентность опухоли к терапевтическому воздействию. Единственный путь возможной стабилизации пренеопластического кариотипа, с позиций теории видообразования, это время необходимое на формировании неопластического кариотипа и естественный путь формирования нового вида, то есть новой линии раковых стволовых клеток. Но из клинической практики мы хорошо знаем, что этого времени у онкологических пациентов со злокачественными опухолями практически нет, и в большинстве случаев, при злокачественном процессе организм пациента не успевает дожить до окончательного формирования нового вида соматических клеток, и умирает от раковой интоксикации или неуправляемого процесса метастазирования рака по органам и системама пациента. Получается, что теория видообразования рака методологически «закрывает» все возможные перспективы лечения этого заболевания, так как гетерогенные раковые клетки опухоли являются эволюционирующими формами межвидового перехода от соматических клеток существующего вида человека к новому виду с неопластическим кариотипом. Очевидно из всего вышеизложенного, что любые терапевтические воздействия на эти переходные формы приведут к включению в них генетических механизмов самосохранения и самовыживания соматической клетки с пренеопластическим кариотипом в рамках пределов гибкости и существующих рамок автономии возможного видоизменения. Что же делать? Получается, что новая теория проихожденния рака P. Duesberg et al., (2011), которая объединяет все существующие знания о канцерогенезе опухолей и объясняет очень важные фундаментальные факты канцерогенеза, не только не способствует разработке новых инновационных терапий, а даже наоборот доказывает эволюционную невозможность создания этих терапий путем уничтожения раковых клеток и раковых стволовых клеток .

Мы полагаем, что дело здесь не в сути и содержании «теории видообразования рака». Вероятно с позиций биолога, гистолога и цитоморфолога, изучающего формирование рака, она абсолютно верна и правильна. Возможно, основная причина методологического тупика для клинической онкологии и определенных лимитов в возможности создания новых терапий рака заключается в ее не очень корректных формулировках и самой методологии терапии. Канцерогенез это многоэтапный морфофункциональный процесс генерации ракового кариотипа в клетке за определенный ( достаточно длительный) период времени, а видообразование это закономерный исход этого процесса. Поэтому формулировка P. Duesberg et al., (2011) о том, что «канцерогенез это форма видообразования рака» , скорей всего метафора, которая не достаточно верна по сути. Канцерогенез это не статическая форма образования вида, а динамический процесс трансформаций кариотипа клеток, имеющий огромное количество переходных форм пренеопластических кариотипов, проявляющихся гетерогенными фенотипами соматических клеток организма пациента. Правильнее было бы сказать , что канцерогенез это эволюционный саногенетический механизм самосохранения видовой принадлежности и универсальный способ стабилизации пренеопластического кариотипа РСК. Эта формулировка канцерогенеза четко дает представление о том, что на каждом определенном этапе образования опухоли имеется очень индивидуальная в определенном периоде времени неустойчивость кариотипа, обусловленная скоростью и массивностью образования анеуплоидий в соматической клетке. Канцерогенез это универсальный способ соматической клетки с пренеопластическим кариотипом избавиться от хромосомных обераций и анеуплоидий путем банального и традиционного способа самосохранения – клеточного деления. Таким образом, «неуправляемая» пролиферация раковых клеток, сопровождающаяся постоянными делениями этих клеток и характеризующаяся формированиями гетерогенной популяции раковых клеток в опухоли не является процессом бесконтрольным и не регулируемым. Наоборот, с позиций теории видообразования в канцерогенезе рака, митозы раковых клеток это абсолютно контролируемый клеткой процесс самокомпенсации и стабилизации ее кариотипа в рамках существующего вида. Клетка абсолютно направленно изменяет протоонкогены на онкогены и подвляет супрессорные механизмы противоопухолевого воздействия . Пытаясь сохранить видовой кариотип, соматическая клетка с анеуплоидиями продолжает абсолютно целенаправленно делиться, предполагая, что в перспективе этих делений она все-таки обретет свой видовой кариотип, а клетки, полученные в результате этого деления, с измененым кариотипом погибнут от летальной анеуплоидии, так как не смогут дифференцироваться во взрослые клетки. Исходя из этих соображений, получается, что канцерогенез рака это очень продуманный, системный, генетически детерминированный и запрограммированный эволюционный механизм самосохранения и саморегуляции видовой принадлежности соматических клеток. И процесс длительного видообразования обусловлен не трудностями формирования нового вида, а отлаженными и четкими механизмами сохранения гомеостаза и компенсации соматической клетки.

Молекулярнонацеленные (таргетные) биомедицинские клеточные продукты на основе стволовых клеток для регенерации мозга и терапии злокачественных опухолей

источник