Инъекция для рака молочной железы

Для остановки роста злокачественной опухоли молочной железы требуется серьезное и правильное лечение. Учитывая индивидуальные особенности и степень распространения заболевания, подбираются необходимые противоопухолевые средства и препараты: химиотерапия, хирургическое вмешательство и таблетки от рака молочной железы.

В зависимости от разновидности опухоли: гормонально-позитивная или гормонально-негативная, назначаются необходимые препараты.

Если опухоль гормонально-позитивная (ЭРц-позитивная), значит, что ее клетки стремительно делятся за счет эстрогена, протестерона – гормонов, вырабатываемых в большом количестве у женщин и небольшом у мужчин. В этом случае назначается гормональная терапия (антиэстрогеновая), при которой сокращается выработка эстрогена, прекращается его воздействие на раковые клетки, и, соответственно, их питание и рост. Такое лечение снижает риск новообразований.

Если опухоль гормонально-негативная (ЭРц-негативная – 25 % всех опухолей), то действие гормональной терапии не будет иметь никакого результата.

Лечение рмж должно быть комплексным. Обычно, для достижения эффективного результата комбинируют химиотерапию, облучение или хирургическое вмешательство с гормональными препаратами.

ЭРц-позитивная опухоль имеет 4 вида гормональной терапии, каждый из них по-своему воздействует на организм:

Полное прекращение выработки гормона;
Блокирование гормональных рецепторов;
Снижение уровня гормона в крови.

Это лекарственные препараты, снижающие количество гормонов в крови. Назначают только после менопаузы. К ним относятся следующие препараты:

Фемара (снижает синтез гормонов в тканях, подавляет рост опухоли);
Экземестан (блокирует ферменты, отвечающие за выработку эстрогенов);
Анастразол (противоопухолевое средство, ингибирующее воздействие).

Могут иметь побочный эффект в виде: тошноты, сухости во влагалище, боли в суставах, покраснений, хрупкости костей.

Блокируют гормональные (эстрогеновые) рецепторы, подавляя эффект гормона, таким образом он перестает влиять на раковые клетки. Действует селективно, т.е. избирательно, не на все рецепторы. Лекарства данной категории могут стимулировать гормональные рецепторы в других тканях и органах, что может оказывать как отрицательное, так и положительное влияние. Также препараты могут подавлять образование новых кровеносных сосудов в опухоли.

Тамоксифен – угнетает деление злокачественных клеток, что приводит к их гибели. Побочные эффекты: повышает риск появления инсульта и сгустков крови, рака матки, тошнота, диарея, кожные высыпания. Оказывает незначительное эстрогеновое действие;

Фарестон – противоопухолевое лекарство от рака. После приема могут появиться следующие симптомы в легкой форме: головная боль, кожная сыпь, потливость, утомляемость.

Медикаментозное (Госелерин, Леупролид – 1 раз в месяц проводится инъекция для подавления выработки гормона яичниками), облучение, хирургическое (удаление яичников).

При онкологии молочной железы действие препарата направлено на уничтожение рецепторов, тем самым прекращая влияние гормона на опухоль.

Фаслодекс назначается, когда ингибиторы и СМЭР уже не действуют нужным образом. Назначается только при постменопаузе. Вводят инъекциями. К побочным эффектам относятся: отечность, головные боли, расстройство желудка, покраснения.

Препарат назначается в зависимости от менструального цикла, стадии онкологии, особенностей рака, состояния здоровья.

Если какой-либо из этих препаратов оказал положительный результат, то необходимо продолжать его прием как можно дольше, когда действие лекарства прекратится, нужно переходить на другое, т.к., возможно, организм уже привык и для остановки роста опухоли требуется более сильная гормональная терапия.

При онкологии груди также назначают алкилирующие лекарства.

Действие этих препаратов заключается в повреждении ДНК; присоединении алкильных групп к ДНК злокачественной клетки, таким образом, теряется возможность деления, наступает гибель пораженной клетки. Лечение довольно успешное, но большим недостатком является токсическое действие. Здоровые клетки делятся с меньшей скоростью, чем раковые, поэтому подвержены побочным эффектам костный мозг, слизистая пищеварительного тракта, дыхательные и мочевыводящие системы, кожа и др. Применение вызывает канцерогенное, мутагенное действия, чревато тяжелыми последствиями, вызывает сильную рвоту, угнетает кровотечение.

Алкилирующие препараты, применяемые для гибели злокачественных клеток молочной железы в виде таблеток:

Это препараты, тормозящие клеточный рост и нарушающие функцию клеток – оказывают цитостатическое действие. Молекула этого вещества очень схожа по структуре с молекулой эндрогенных продуктов обмена веществ. Относятся к химиотерапевтическим лекарствам.

Прием препаратов приводит к понижению содержания тромбоцитов, эритроцитов, лейкоцитов, т.е. угнетению кровотечения; расстройству пищеварения и др.

Действие направлено на препятствие создания нуклеиновой кислоты, которая хранит, передает наследственную информацию в ДНК, развитие злокачественных клеток прекращается, что останавливает онкологический процесс. Тяжело переносятся организмом из-за высокой токсичности. К осложнениям после применения относятся: сердечная недостаточность, аллергия, тошнота и др.

Эпирубицин;
Доксорубицин;
Идарубицин и др.

Лечение должен выбирать только доктор, исходя из показаний обследования и состояния здоровья. Таблетки должны быть в комплексе с основным лечением, поэтому их можно считать дополнительной терапией.

источник

Способы лечения рака молочной железы зависят от стадии онкопроцесса и наличия вторичных образований.

Лечение рака молочной железы опирается на результаты генетического, иммунологического исследования, изменений в общеклинических и биохимических анализах, а также от наличия сопутствующих заболеваний.

Новые технологии приходят в Россию.

Приглашаем пациентов принять участие в новых методах лечения онкологических заболеваний, а также в клинических испытаниях препаратов на основе Т-клеток (LAK-терапия). Терапия проводится в различных научно-исследовательских онкологических центрах, в зависимости от вида опухоли.

Отзыв о методе министра здравоохранения РФ Скворцовой В.И.

Комментарий о клеточных технологиях главного онколога России, академика Давыдова М.И.

1. Первый этап болезни – удаление опухоли.

2. Вторая стадия – радикальное удаление, зачастую проводится расширенная мастэктомия. Лечение рака молочной железы дополняется лучевой и химиотерапией, возможны к назначению иммунологические и гормональные средства.

В настоящее время основная тенденция на начальных этапах – максимально сохранить нетронутые опухолью ткани. Зачастую лечение рака молочной железы сочетается с проведением радиотерапии, чтобы минимизировать размеры злокачественности во время хирургического лечения.

Их можно разделить на 2 большие группы:

• местного воздействия – облучение, операция,

• системного влияния – химио-, гормоно- и иммунотерапия.

При этом врачи руководствуются преимущественно следующими критериями:

• Маленькие онкоочаги и отсутствие отдаленных метастаз – секторальная резекция железы или мастэктомия с иссечением лимфоузлов, проведение инраоперационной биопсии, по результатам которой обычное удаление заменяют расширенной мастэктомией.

• В случае крупного онкообразования и наличия отдаленных патологий – химиотерапия и другое консервативное лечение рака молочной железы.

РМЖ часто является гормонозависимой опухолью, на рост которой влияют различные железы внутренней секреции. В ходе клинических наблюдений выявилось, что некоторые гормоны, в первую очередь эстрогены, прямо или опосредованно влияют на появление и дальнейшую скорость роста. Поэтому еще недавно самым популярным лечением рака молочной железы была овариоэктомия (удаление яичников), хотя полное излечение при этом наступало лишь у трети женщин.

Впоследствии были более досконально изучены механизмы воздействия гормонов на опухолевую ткань, включая действие по принципу положительной и обратной отрицательной связи. И с начала семидесятых годов прошлого столетия наступил прорыв в лечении рака молочной железы: были созданы и протестированы различные новые лекарственные препараты, обеспечивающие блокирование рецепторов гормонозависимых опухолей (тамоксифен, торемифен) или подавляющие производство эстрогенов (аримидекс, фемара).

Достаточно успешной альтернативой удалению яичников стал препарат госерилин (золадекс), который успешно подавляет образование эстрогенов на строго определенное время. Создавая таким образом состояние медикаментозного климакса и применяя комплексную терапию можно добиться успеха в лечении рака молочной железы. А после завершения терапевтического курса и при прекращении приема золадекса, яичники начинают функционировать снова.

Лечение рака молочной железы препаратом Тамоксифен является наиболее часто используемым лекарством при гормонозависимых раках. Однако у него имеются серьезные побочные эффекты, включая малигнизацию эндометрия и повышение риска возникновения тромбоэмболии.

Поэтому в последние годы был предложен целый ряд лекарств, ингибирующих ароматазу, например:

Другие средства – аромазин, фемара. Они особенно показаны после приема тамоксифена в течение 5 последних лет.

Разработки ученых увенчались успехом, найден способ воздействовать на опухоль – это таргетные препараты. Сегодня таргетная терапия является серьезным продвижением в современной онкологии.

Органосохраняющую операцию выполняют в случае размера онкоочага до 2,5 см. Однако в качестве профилактики рецидива возможно иссечение регионарных лимфоузлов. При классической мастэктомии происходит полное удаление всех тканей железы. Установка протеза и пластика груди выполняются или непосредственно во время хирургического вмешательства, или спустя шесть месяцев. Это зависит от общего состояния пациентки и характера операции.

Онкохирурги рекомендуют следующие виды удаления молочной железы:

• иссечение лишь ее сектора – лампэктомия,

• полностью, но без резекции лимфоузлов подмышечной группы,

• с удалением лимфоузлов регионарных – модифицированная радикальная мастэктомия,

• единым блоком с прилежащими к ней мышцами – радикальная мастэктомия (расширенная),

• удаляются все ткани железы за исключением кожи и соска (важно для последующей реконструкции груди).

В лечебных дозах ионизирующее излучение угнетает развитие онкоклеток и вызывает их разрушение. Таким способом можно воздействовать на первичную патологию, и метастазы. Радиооблучение может стать единственным вариантом в качестве самостоятельного метода при неоперабельности новообразования или использоваться с целью минимизации размеров злокачественного процесса перед проведением хирургии.

После мастэктомии облучение ложа опухоли существенно уменьшает вероятность рецидива. В качестве основного метода радиотерапии обычно используется дистанционное облучение. Современные аппараты позволяют минимизировать поражение здоровых тканей, концентрируя свое пагубное воздействие именно в пределах опухолевого очага. Поэтому сегодня крайне редко наблюдаются типичные осложнения, возникающие после завершения курса радиотерапии, включая радиационные ожоги.

Обычно молочный рак имеет свойство метастазировать практически во все органы, включая легкие, кости, печень, брюшную полость и кожные покровы. Лечение отдаленных от материнского новообразования опухолей зависит от следующих факторов:

• размеры метастаз, их количество, локализация,

• степень чувствительности онкоклеток к эстрогенам, прогестерону,

• особенности функционирования яичников (состояние фертильности или климакс).

Наиболее успешно в лечении метастаз РМЖ считаются следующие средства:

Они часто сочетаются с медикаментами, уменьшающими токсичность первых и снижающими вероятность возникновения или выраженность уже существующих побочных эффектов. Например, при добавлении преднизона снижается токсическое воздействие на кроветворную систему и органы пищеварения, однако повышается вероятность появления тромбозов и вторичной инфекции. С целью повышения терапии цитостатиками также могут назначаться предварительные курсы иммуномодуляторами, включая интерфероны, интерлейкины и различные моноклональные антитела.

В случае рецидива показаны гормональные препараты и цитостатики. Если же положительного эффекта не наблюдается, то рекомендуют клеточную биоиммунотерапию или использование препаратов, проходящих клинические испытания.

После хирургического иссечения необходимо встать на учет у онколога и регулярно являться на контрольные осмотры. Они нужны для того, чтобы своевременно заметить возобновление злокачественного роста и предпринять соответствующие меры. Сначала визиты к доктору необходимы каждые 5 месяцев, а по прошествии 5 лет – ежегодно. На фоне лечения тамоксифеном важно ежегодно проходить ПЭТ или МРТ органов малого таза, чтобы своевременно обнаружить раковое перерождение клеток эндометрия. А при употреблении ингибиторов ароматазы – остеоденситометрию (проверку минеральной плотности костей). В случае рецидива или обнаружения МТС назначается курс химио- и лучевой терапии.

Когда дело касается онкобольных, то основным критерием эффективности проводимого лечения является показатель пятилетней выживаемости. Молочный рак имеет показатель чуть более 50%. Однако, перешагнув эту черту, рецидивов в ближайшие годы уже практически дальше не наблюдается.

Продолжительность жизни зависит от таких факторов, как:

• характер и скорость ее роста,

Наиболее неблагоприятным считается прогноз при диффузном типе роста клеток и запущенной форме болезни при наличии отдаленных МТС. В этом случае показатель пятилетней выживаемости практически равен нулю.

Однако при ранней диагностике заболевания и начале своевременного лечения шансы увеличить порог выживаемости значительно возрастают. Так при второй стадии 80% женщин живут более 5, а чаще и 10 лет, а свыше половины из них перешагнут и двадцатилетний рубеж. Вероятность успешного излечения значительно повышается при использовании сразу нескольких видов терапии.

В случае третьей стадии рака 5 и более лет живут 40-60% женщин (зависит от того, подстадия 3А или 3В). Однако и здесь адекватная медицинская помощь способна повысить продолжительность жизни и сделать ее более комфортной.

Для подбора эффективного метода лечения вы можете обратиться за

— методы инновационной терапии;
— возможности участия в экспериментальной терапии;
— как получить квоту на бесплатное лечение в онкоцентр;
— организационные вопросы.

После консультации пациенту назначается день и время прибытия на лечение, отделение терапии, по возможности назначается лечащий доктор.

источник

Гормональная терапия является эффективным методом лечения гормональнозависимых опухолей молочной железы. Иногда ее называют антиэстрогеновой терапией, так как она направлена на предотвращение воздействия эстрогена на онкологические клетки.

В Москве на онкологических болезнях (в том числе и на раке молочной железы) специализируются врачи Юсуповской больницы. Это одно из лучших учреждений по оснащенности, высококвалифицированным врачам, ценовой политике, качеству оказываемых услуг и сервису, в котором процент положительного исхода лечения один из самых высоких в стране.

В большинстве случаев гормональная терапия оказывает эффективное действие, так как 75% всех опухолей, расположенных в молочных железах, имеют гормонзависимую природу. В зависимости от общего состояния пациентки, стадии заболевания, характера течения, распространенности, менопаузального статуса доктор подбирает оптимальную схему лечения. Ее нужно строго придерживаться, ведь только так можно достичь положительного результата.

Показаниями к назначению гормональной терапии являются:

снижение вероятности возникновения рака у женщин, которые не страдают этим заболеванием, но находятся в зоне высокого риска;
снижение риска рецидивов при неинвазивном раке;
снижение вероятности рецидива или появления новых опухолей после оперативного вмешательства, химиотерапии и лучевой терапии;
уменьшение размеров опухоли при инвазивном раке;
метастатический рак.

Гормонотерапию часто называют «страховкой» после применения других методов лечения рака, так как операция, лучевая терапия и химиотерапия не могут дать 100% гарантию, что пациентка не заболеет вновь. Препараты гормонотерапии оказывают влияние на весь организм, подавляя действие эстрогена, и назначаются только в случаях гормонозависимых опухолей.

В Юсуповской больнице применяется только лучшее диагностическое оборудование от производителей с мировым именем, полный перечень лекарственных препаратов (антибиотики, химиопрепараты, гормональные таблетки и инъекции).

адъювантная (профилактическая);
неоадъювантная;
лечебная.

Применяется как дополнительная терапия после оперативного вмешательства, химического облучения и лучевой терапии с целью профилактики рецидивов. Обычно такая терапия длится от 5 до 10 лет, при этом доктор назначает препараты ингибиторов ароматазы или тамоксифен.

Неоадъювантная терапия представляет собой комплексное лечение перед проведением оперативного вмешательства или лучевой терапией. Она применяется в следующих случаях:

для уменьшения размеров опухоли и ее метастазов;
для уменьшения объема хирургического вмешательства;
для увеличения безрецидивной и общей выживаемости;
для определения чувствительности опухоли к цитостатикам;
для оценки новых способов лечения.

Такая терапия длится от 3 до 6 месяцев, хотя при положительном результате лечение продлевается.

Назначается пациенткам с неоперабельным раком и при генерализации. Также лечебную терапию назначают молодым женщинам с метастазами в печень или легкие, а также в период ремиссии.

Выбор лечения рака молочной железы зависит от многих факторов, среди которых:

гормональный статус обнаруженной опухоли;
менопаузальный статус женщины;
стадия заболевания;
применяемые ранее способы лечения;
наличие сопутствующих соматических болезней;
риск развития рецидива.

После применения неоадъювантной терапии у 80% пациенток опухоль уменьшается в размерах, а у 15% — отмечена полная морфологическая ремиссия.

Все виды терапии применяются в Юсуповской больнице. Врач, учитывая состояние пациентки, природу опухоли и стадию заболевания, подберет оптимальную схему лечения, которая поможет в эффективном лечении.

Гормонотерапию при раке молочной железы подбирают в зависимости от того, сохранен ли у женщины менструальный цикл. Так, пациенткам в пременопаузе (менструальный цикл постоянный) назначают:

тамоксифен сроком на 5 лет (на ранних стадиях заболевания);
операцию по удалению яичников;
после удаления яичников или подавления их функции с помощью медикаментов назначают ингибиторы ароматазы.

Женщинам в период менопаузы (пациентка находится в климактерическом или постклимактерическом состоянии):

назначают ингибиторы ароматазы после хирургического вмешательства, химической и лучевой терапии;
если пациентка до менопаузы принимала тамоксифен, то его заменяют ингибиторами ароматазы;
если женщина принимала тамоксифен на протяжении последних 5 лет, то его заменяют фемарой;
если при лечении тамоксифеном была выявлена новая опухоль или рецидив, то вместо него назначают ингибиторы ароматазы;
если в период приема ингибитора ароматазы выявлен рецидив, то его заменяют на тамоксифен, фаслодекс или назначают другой ингибитор ароматазы.

Опухоли по своей природе могут быть доброкачественными и злокачественными. Если опухоль доброкачественная, при этом существует риск ее перехода в рак, то единственным препаратом, который назначается таким пациенткам, является тамоксифен. Также он применяется при обнаружении протоковой карциномы in situ.

Женщинам с HER2-позитивным раком предпочтительнее назначать ингибиторы ароматазы. Также они назначаются, если тамоксифен оказался нерезультативным.

Относится к группе антиэстрогенов и препятствует соединению эстрогенов с раковыми клетками, что, соответственно, не дает последним увеличиваться. Его назначают женщинам на ранних стадиях заболевания и в период предменопаузы.

Одно из торговых названий этого препарата – Тамоксифен-Нолвадекс (в таблетках). У некоторых пациенток при их приеме отмечается сухость влагалища или, наоборот, чрезмерные выделения, усиленное потоотделение, покраснение кожи, увеличение веса.

Эти препараты блокируют выработку эстрогенов в организме женщины и назначаются пациенткам уже после наступления менопаузы. Как показывает практика, многим женщинам удалось преодолеть рак молочной железы благодаря приему одного из этой группы препаратов (аримидекс, фемара, аромазин). Каждый препарат назначается в определенных случаях:

аримидекс – на ранних стадиях заболевания сразу после удаления опухоли;
аромазин – на ранних стадиях рака тем женщинам, которые ранее несколько лет принимали тамоксифен;
фемара – на ранних стадиях болезни после оперативного вмешательства пациенткам, которые принимали тамоксифен 5 и более лет.

У большинства женщин прием этих препаратов не вызывает никаких негативных симптомов, но некоторые отмечают тошноту, сухость во влагалище и боль в суставах. Также длительный прием ингибиторов ароматазы может стать причиной хрупкости костей, поэтому вместе с данными препаратами параллельно назначают кальций и витамин Д.

Этот препарат является аналогом природного ЛГРГ и применяется для подавления работы гипофиза. Он снижает количество гормонов, которые вырабатывают эстрогены, но при прекращении его приема гипофиз начинает работать в усиленном режиме. Поэтому врачи после нескольких месяцев приема золадекса рекомендуют операцию по удалению яичников (овариоэктомию) хирургическим способом или путем облучения.

Побочное действие препарата заключается в снижении полового влечения, покраснении, сильном потоотделении, головных болях, перепадах настроения. Золадекс вводят внутримышечно в нижнюю часть брюшной стенки 1 раз в месяц.

Несмотря не огромную пользу, гормонотерапия имеет ряд негативных последствий. Примерно половина женщин, которым назначается гормонотерапия при раке молочной железы, отмечают:

увеличение массы тела;
потливость;
отечность;
сухость влагалища;
преждевременное наступление менопаузы;
перепады настроения, депрессия.

Широко используемый препарат тамоксифен может стать причиной образования тромбов, рака матки и бесплодия. Препараты, которые направлены на снижение уровня эстрогенов (ингибиторы ароматазы), в некоторых случаях приводят к остеопорозу, повышению холестерина, заболеваниям ЖКТ. При появлении вышеперечисленных симптомов следует немедленно обратиться к доктору. Он сможет подобрать другие оптимальные лекарства.

С момента обнаружения опухоли в молочной железе женщине нужно пересмотреть свой рацион. Правильно подобранная диета позволит значительно улучшить общее самочувствие и снизить риск дальнейшего развития заболевания.

Питание при раке должно быть максимально сбалансированным, с большим количеством витаминов и микроэлементов. Кушать необходимо часто, но маленькими порциями, при этом придерживаться принципа раздельного питания.

Врачи Юсуповской больницы считают, что питание при гормонотерапии рака молочной железы должно быть именно таким:

употреблять много ярко окрашенных овощей и фруктов (морковь, тыква, томаты, капуста, клюква, чеснок) и злаков (коричневый рис, пророщенная пшеница, отруби);
калорийность рациона должна зависеть от веса пациентки: женщинам с лишним весом с помощью диеты нужно попытаться избавиться от лишних килограммов;
уменьшить количество животных жиров в рационе и увеличить количество растительных;
употреблять пищу, богатую кальцием и витамином Д;
отказаться от продуктов, в состав которых входят фитоэстрогены;
полностью исключить копченую, жареную, соленую, острую пищу и продукты с консервантами;
ограничить количество сахара (в том числе и напитков с его содержанием);
полностью отказаться от алкоголя, курения и наркотических средств;
как можно меньше кушать красное мясо;
обязательно добавить в рацион морскую рыбу, морепродукты, морскую капусту;
ежедневно употреблять 1-2 порции молочных продуктов;
пить как можно больше сырой воды (не менее 2-2,5 л в день), зеленого чая и отваров из травяных сборов.

В Юсуповской больнице есть все необходимое оборудование для диагностики и лечения заболевания, а при выявлении образования в молочной железе в лаборатории можно сделать анализ на определение его природы.

Важно заметить, что каждая женщина в возрасте после 35 лет должна раз в год посещать маммолога чтобы исключить вероятность патологических образований в груди. Это можно сделать в Юсуповской больнице, которая находится по адресу: 117186, г. Москва, ул. Нагорная, д.17, корп.6, предварительно записавшись на прием.

источник

Соответствие: Pepper Schedin at schedin@ohsu.edu

Рак молочной железы является основной причиной смертности от рака у женщин во всем мире. Метастазы печени участвуют в 30% случаев метастазирования рака молочной железы и приводят к плохим результатам с медианной выживаемостью всего 4,8 — 15 месяцев. Современные модели грызунов метастазов рака молочной железы, включая первичные опухолевые клеточные ксенотрансплантаты и спонтанные опухолевые модели, редко метастазируют в печень. Внутрисердечные и внутрисплавные модели инъекций приводят к метастазам в печени, однако эти модели могут быть смешаны сопутствующими метастазами вторичного участка или скомпрометированным иммунитетом из-за удаления селезенки, чтобы избежать роста опухоли в месте инъекции. Чтобы устранить необходимость в улучшенных моделях метастазов в печени, был разработан метод инъекции мышиной воротной вены, который поставляет опухолевые клетки сначала и непосредственно в печень. Эта модель поставляет опухолевые клетки в печень без осложнений одновременных метастазов в других органах или удаления селезенки. Оптимизированный протокол венковой вены использует небольшие объемы инъекций 5-10 мкл, иглы 32 калибра и гемостатическая марля в месте инъекции для контроля за кровопотери. Был испытан подход к инъекции воротной вены у самцов мышей Balb / c с использованием трех сингулярных линий опухолей молочной железы различного метастатического потенциала; высокометастатические клетки 4T1, умеренно-метастатические клетки D2A1 и низкометастатические клетки D2.OR. Концентрации ≤ 10000 клеток / инъекция приводят к латентности

20-40 дней для развития метастазов в печени с более высокими метастатическими линиями 4T1 и D2A1 и> 55 дней для менее агрессивной линии D2.OR. Эта модель представляет собой важный инструмент для изучения метастазирования рака молочной железы в печени и может быть применима к другим раковым заболеваниям, которые часто метастазируются в печень, включая колоректальную и панкреатическую аденокарциному.

Метастаз рака молочной железы в печень

Печень является распространенным местом метастазов рака молочной железы, а также кости и легких1-3. Метастаз печени у пациентов с раком молочной железы является независимым прогностическим фактором для очень плохих результатов4,5, так как медианная выживаемость больных раком молочной железы с метастазами в печени составляет от 4,8 до 15 месяцев6-9. Напротив, пациенты с раком молочной железы с метастазами в легкие или кости имеют среднюю выживаемость от 9 до 27,4 месяцев8,9 и 16,3 до 56 месяцев8,10-12 соответственно. Метастаз — это многоступенчатый процесс, называемый метастатическим каскадом, который начинается с распространения опухолевых клеток в первичной опухоли и заканчивается смертностью пациентов из-за посева и роста циркулирующих опухолевых клеток в удаленном органе13-15. Модели метастазирования грызунов показали, что метастатический каскад необычайно неэффективен, и только 0,02-10% циркулирующих опухолевых клеток обнаруживают явные метастазы16,17. Одним из основных узких мест в метастатической неэффективности продиктована уникальная тканевая микросреды на вторичных участках, называемые метастатическими нишами18, подчеркивая важность понимания метастазирования сайта. Метастатическая ниша уникальна для места рецидива и частично характеризуется осаждением отдельных белков внеклеточного матрикса19,20, инфильтрацией различных популяций иммунных клеток21-23 и измененным тканевым гомеостазом, включая дисрегуляционное производство многочисленных цитокинов, хемокинов, и факторы роста15,18,24,25. Таким образом, понимание специфической тканевой метастатической ниши предшествует пониманию того, как нацелить метастатическую болезнь. Однако нет надежных моделей метастазов в печени. Кроме того, улучшенные модели метастазов в печени будут необходимы для выявления новых целей и эффективного лечения пациентов с раком молочной железы с метастазами в печени.

Установленные модели для изучения метастазирования рака молочной железы в печени

В настоящее время доступны модели для изучения метастазирования рака молочной железы в печени, включая ксенотрансплантаты раковых клеток человека у иммунных скомпрометированных мышей. Эти модели обычно используют хорошо изученные клеточные линии рака молочной железы человека, такие как MCF-7 и MDA-MB-231 и Nude, Rag1 — / — или SCID, иммунные скомпрометированные мышиные хозяева 26-29. Тем не менее, модели ксенотрансплантатов дают возможность использовать линии клеточных линий человека, учитывая недавнюю оценку иммунных клеток при метастазировании30-32 и терапевтической резистентности 33-35, изучение метастазов у полностью иммунного компетентного хозяина имеет первостепенное значение. Модели для исследования метастазов рака молочной железы в печени у компетентных иммунных хозяев включают ортотопическую инъекцию сингенных опухолевых клеток (например, клеточных линий 4T1 и D2A1) в молочную жировую подушку с хирургической резекцией первичной опухоли или без нее и последующую оценку метастазирования36 -38. Следует отметить, что частота метастазов в печени из ортотопических моделей трансплантации очень низкая или не существует по сравнению с другими метастатическими участками, такими как легкие39,40, или возникает после метастазов в легкие, что осложняет изучение метастазирования в печени37,39.

Эксплантаты опухолей из самопроизвольных генетически модифицированных моделей рака молочной железы могут быть повторно введены в молочные жировые подушки наивных хозяев в виде сингенных опухолевых клеток. Например, недавно сообщалось, что спонтанные опухоли у мышей K14CreECadf / fP53f / f, которые моделируют инвазивную лобулярную карциному молочной железы, развивают опухоли при ортотопическом введении в организм дикого типа. После хирургической резекции этих опухолей, когда они достигают 15 мм2, 18% мышей прогрессировали до метастазирования печени 40, 41. Третий подход к моделированию метастазов печени использует спонтанные метастазы у мышей с генной инженерией. На сегодняшний день сообщения о спонтанных мышиных моделях метастазов рака молочной железы, которые легко распространяются в печени, являются необычными. Исключения включают в себя H19-IGF2, p53fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre и генетически модифицированные мышиные модели K14CreECadf / fP53f / f, где метастазы в печени развиваются в низком проценте мышей38,41-43. Таким образом, хотя генетически модифицированные мышиные модели облегчают изучение всех стадий метастатического каскада, обеспечивая мощные и клинически значимые модели, они ограничены из-за низких показателей метастазирования печени38.

Несколько моделей метастазов обходят начальные стадии метастатического каскада, включая распространение опухолевых клеток из первичной опухоли и интравазии. Эти модели позволяют исследовать более поздние стадии метастатического каскада, от экстравазации до образования опухолей на вторичных участках. Модель внутрисердечной инъекции поставляет опухолевые клетки в левый желудочек, который распределяет опухолевые клетки в систему кровообращения через аорту. Интракардиальная инъекция требует ультразвуковой визуализации места инъекции или других методов визуализации, таких как биолюминесценция клеток, меченных люциферазой, для подтверждения успешной инъекции. Инъекция опухолевых клеток через левый желудочек может привести к метастазированию кости, мозга, легких и / или печени, среди других органов44-48. Из-за многоорганических метастазов эти мыши часто нуждаются в эвтаназии до развития явного метастаза в печени, что отрицает способность полностью исследовать метастатический рост в печени. Альтернативный подход, который значительно минимизирует развитие многосайтовых метастазов, — это модель интраспенической инъекции. Intrasplenic инъекции поставляет опухолевые клетки через селезеночную вену, которая соединяется с верхней брыжеечной веной, чтобы стать воротной веной49,50. Животных можно контролировать для роста метастатических поражений в печени, потому что образование метастазов на других участках встречается редко, и, как результат, общее состояние животного поддерживается49,50. Тем не менее, важно отметить, что внутрисложная модель требует спленэктомии, чтобы избежать опухолей селезенки49,50, что влияет на иммунную функцию. Например, реперфузионное повреждение ишемии миокарда характеризуется инфильтрацией подтипов моноцитов Ly6C +, которые происходят из селезенки и ответственны за фагоцитарную и протеолитическую активность во время заживления ран после ишемии51,52. При спленэктомии наблюдается наблюдаемое уменьшение популяций моноцитов, которые помогают в заживлении раны52. Кроме того, было показано, что спленэктомия снижает первичный рост опухоли и метастазы в легкие в модели немелкоклеточного рака легкого, в частности, путем сокращения количества циркулирующих и внутриопухолевых моноклитических миелоидных клеток CCR2 + CD11b + Ly6C +53. Кроме того, спленэктомия после внутриплодной инъекции раковых клеток толстой кишки приводила к уменьшению уровней противоопухолевых естественных киллерных клеток в брыжеечных лимфатических узлах и повышенных метастазах в печени54. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что спленэктомия ставит под угрозу роль иммунной системы с последующими последствиями для судьбы метастатической клетки.

Модель введения в вену вены для метастазов печени

Чтобы исследовать метастазы рака молочной железы в печени у полностью иммунного компетентного хозяина, в условиях, когда мыши не подвергаются риску из-за многоорганических метастазов, была разработана модель инъекции воротной вены. Внутрипортологические модели инъекций использовались ранее для изучения метастазов в печени колоректальных клеток 55,56 и меланомы16; здесь мы описываем применение внутрипортовой инъекции для моделирования метастазирования метастазов опухолевых клеток сингенных мамморий. Эта модель может быть использована для изучения более поздних стадий метастатического каскада, включая экстравазацию и сеяние раковых клеток молочной железы, решения о судьбе опухолевых клеток в отношении смерти / пролиферации / покоя и перерастания в явные поражения. В этой модели синтетические линии клеток опухоли молочной железы вводят через портальную вену иммунных компетентных самцов мышей Balb / c, метод, который поставляет опухолевые клетки сначала и непосредственно в печень без удаления селезенки. Для разработки этой модели использовались четыре линии клеток опухоли молочной железы, которые варьировались в зависимости от их метастатической способности от низкого до высокого: D2.OR, D2A1 и 4T1, и использовали D2A1 с меченым зеленым флуоресцентным белком (D2A1-GFP) до исследовать ранние моменты времени после инъекции опухолевых клеток. 4T1 представляет собой высокометастатическую клеточную линию, полученную из опухоли 410,4, которая спонтанно возникла в мышиной мыши MMTV + Balb / c 36,37 и метастазирует в легкие, печень, головной мозг и кость из первичных опухолей молочных желез 39,57,58. Опухолевые клетки D2A1 также были первоначально получены из спонтанной опухоли молочной железы, возникающей у хозяина Balb / c после трансплантации гиперпластических клеток альвеолярного узла D2, и подтверждены, что они являются метастатическими от первичной опухоли до легкого5,9,60. D2.OR опухолевые клетки являются неметастатической сестринской линией к линии D2A1 и, хотя они избегают первичной опухоли и попадают на вторичные сайты, они редко устанавливают отдаленные метастазы 60,61.

Кроме того, важно избегать использования обычно применяемых препаратов для лечения боли, включая нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) во время или после хирургической процедуры. НПВП имеют противоопухолевую активность при определенных раках молочной железы62-65, а некоторые классы НПВП повышают риск гепатотоксичности66,67, что потенциально может поставить под угрозу изучение метастазов в печени и метастатической нити печени. Кроме того, исследования показывают, что NSAIDs непосредственно влияют на микроокружение тканей, уменьшая прометастатические белки внеклеточного матрикса tenascin-C68 и фибриллярный коллаген62,65. Альтернативно, использование опиоидного производного, бупренорфина, использовалось из-за его эффективности в лечении боли грызунов69 и из-за отсутствия доказательств того, что опиоиды обладают противоопухолевой активностью70. Эта модель инъекции венозной вены была оптимизирована для меньших объемов инъекции 5-10 мкл, чтобы избежать ненужного повреждения печени. Модель также была оптимизирована для включения игл с меньшим диаметром (≥ 32 калибра) и использования гемостатической марли сразу после инъекции, чтобы минимизировать потерю крови во время процедуры. В отличие от этих оптимизированных параметров инъекции, количество клеток следует определять индивидуально, исходя из опухолегенного потенциала клеточной линии. Однако рекомендуется начинать с ≤ 10 000 клеток / инъекция для долгосрочных исследований. Для более коротких конечных точек (например, через 24 часа после инъекции) может быть использовано значительно больше опухолевых клеток (например, 1 × 105-1 × 106), если это оправдано. Таким образом, приведенная здесь модель введения венозной вены представляет собой полезный инструмент для изучения метастазирования рака молочной железы в печени и обходит ряд ограничений других моделей метастазов в печени. Эта модель облегчает изучение экстравазации опухолевых клеток, высева, ранних решений о выживании, пролиферации и покоя, а также метастатического роста у иммунных компетентных хозяев мыши.

Все процедуры для животных в этой статье были рассмотрены и одобрены Комитетом по охране и использованию животных в Университете штата Орегон.

Подготовьте ножницы, щипцы и гемостат путем автоклавирования при 124 ° C в течение 30 минут, за 1 — 2 дня до запланированных операций. Обеспечьте доступ к автоклавированным или стерильным постельным принадлежностям, клеткам и пищевым продуктам для последующего хирургического восстановления.

Подготовьте асептическую хирургическую область, предпочтительно в ламинарном вытяжном шкафу. Протрите все поверхности хирургической зоны 10% -ным отбеливателем, включая нагревательную подушку, источник света, анестезиологическую трубку и носовой конус, а также любую другую часть хирургического набора, которая будет находиться в непосредственной близости от хирургической процедуры во время ее выполнения ,

В асептической хирургической области поместите очищенную грелку с помощью стерильной драпировки, источника света, анестезирующей трубки и носекона, инсулиновых шприцев, 1 мл шприцев, бупивакаина, искусственных слез, стерильного физиологического раствора, 2 х 2 «стерильных марлевые губки, 4 х 4» стерильная марля, гемостатическая марля, разрезанная на 0,5-1 см2 кусочки, ножницы, щипцы, гемостат, 4-0 викриловые швы с конической иглой и 50 мл 2% хлоргексидина глюконата в автоклавированном контейнере.

Убедитесь, что в этом помещении есть место для подготовленных опухолевых клеток, хранящихся на льду.

На скамейке рядом с хирургической областью подготовьте зону восстановления со второй грелкой и очистите клетки стерильным постельным бельем. ПРИМЕЧАНИЕ. В этой области также могут храниться предметы, такие как стерилизатор для бисера.

За один час до запланированных инъекций лечите мышей Balb / c в возрасте от 8 до 15 недель с помощью 100 мкл 0,015 мг / мл бупренорфина подкожно для лечения боли. ПРИМЕЧАНИЕ. Этот протокол инъекции может применяться к любому штамму женской или мужской мыши в любом возрасте, используя соответствующие клеточные линии для изменения напряжения.

Подготовьте опухолевые клетки для инъекций на основе протоколов для клеточной линии или эксплантата опухоли. Протестируйте все линии опухолевых клеток до введения для присутствия мышиных патогенов, чтобы уменьшить риск введения таких патогенов в колонию животных. Для сингенных линий опухолевых клеток Balb / c, включая опухолевые клетки D2A1, D2.OR и 4T1, оттаивающие клетки в пластинку для культивирования ткани размером 10 см за 3 дня до инъекции, так что клетки следующего дня находятся в

Через 1 день после промывки клеток оттаивания опухолевых клеток один раз с помощью 1х забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) и трипсинизацию слившихся опухолевых клеток с использованием 2 мл 0,05% трипсина при 37 ° С в течение 5 мин. Добавьте 8 мл полной среды (DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 1x пенициллина / стрептомицина) и прохождение 1:10 в свежую 10-миллиметровую чашку с 10 мл полной среды.

В день инъекций промывайте клетки один раз 1x PBS и трипсинизируйте, как описано выше.

Ресуспендируют трипсинированные клетки в 8 мл полной среды, откручивают в течение 5 мин при 1500 х g, удаляют среду и ресуспендируют в 5 мл 1 × PBS.

Подсчитайте клетки на гемоцитометре, используя исключение трипанового синего для оценки жизнеспособности. Ресуспендируют клетки для инъекций в 1x PBS при заранее определенной концентрации и объеме. ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется 5 — 10 мкл, поскольку меньшие объемы инъекций предотвращают ненужное повреждение печени.

Держите клетки на льду в течение всего времени инъекций. После завершения инъекций верните образец клеток в лабораторию и поместите в культуру в полную среду в течение 1 дня, чтобы обеспечить жизнеспособность.

Поместите мышь под анестезией с 2 - 2,5% изофлураном (2-хлор-2- (дифторметокси) -1,1,1-трифторэтаном), доставленным в кислороде. Поддерживайте температуру тела с помощью нагревательной подушки. Обеспечьте полное обезболивание путем оценки реакции на щепотку пальца ноги, а затем поддерживайте анестезию при 2 — 2,5% изофлуране. ПРИМЕЧАНИЕ. Важно контролировать скорость дыхания животных и соответственно регулировать расход потока изофлурана на протяжении всей процедуры.

Поместите небольшое количество искусственных слез или ветеринарной мази на каждый глаз, чтобы избежать чрезмерной сушки глаз во время хирургической процедуры.

Поместите мышь в лежачее положение, на спине с обнаженным животом.

Удалите волосы на вентральной левой стороне грызуна со второго пространства с ребрами до 4-го пахового молочного соска, протирая область химическим депилятором. Дать депилятору сидеть в течение 1 — 2 мин, а затем полностью удалить марлю и H2O. Этот шаг можно сделать за 1 — 2 дня вперед, чтобы сэкономить время, если запланированы многочисленные операции.

Возьмите одну 2 × 2 «стерильную марлевую губку (пропитанную 2% хлоргексидином) и протрите мышь на месте удаления волос. Стерилизуйте всю окружающую область, включая хвост, чтобы свести к минимуму бактериальное загрязнение инструментов.

Протрите участок удаления волос и прилегающую область спиртовой подушкой.

Повторите 2% хлоргексидина и спиртовую ступеньку еще раз и завершите окончательным очисткой хлоргексидином в общей сложности тремя 2% хлоргексидином и двумя моющими средствами для мытья спиртов. Сделайте окончательный Chlorhexidine вытирать так, что химикат не капает вокруг хирургического участка, чтобы избежать получения хлоргексидина на внутренних органах. ПРИМЕЧАНИЕ. Применение больших количеств хлоргексидина и спирта к коже и окружающему меху может привести к значительному снижению температуры тела. Не протирайте избыточный объем во время шагов 2.7-2.9. Поддерживайте температуру тела с помощью нагревающей подушки.

Используя стерильные перчатки и стерилизованный скальпель со стерильным лезвием, сделайте один разрез 1 дюйм в кожу между срединной и сагиттальной плоскостями с левой стороны мыши, начиная чуть ниже ребер и заканчивая чуть выше плоскости четвертого пахового соска молочной железы.

Используя автоклавные или шариковые стерилизованные ножницы и щипцы, сделайте аналогичный 1-дюймовый разрез в брюшину. Избегайте вырезания молочной жировой прокладки и не разрезайте кишечник, печень или диафрагму.

Поместите 4 × 4-дюймовую марлевую прокладку, смоченную в стерильном физиологическом растворе с левой стороны мыши, где сделан разрез, так что внутренние органы могут быть помещены на марлю и не вступать в контакт с окружающей кожей или хирургической областью.

Подготовьте опухолевые клетки путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, когда опухолевые клетки оседают во время приготовления мыши. Подготовьте 25 мкл съемного иглообразного шприца и иглу 32 калибра с опухолевыми клетками. Нажимайте на шприц до тех пор, пока опухолевые клетки не окажутся на кончике иглы, и плунжер находится в соответствующем объеме для инъекций; избегайте введения пузырьков воздуха.

Протрите снаружи иглу стерильной спиртовой подушкой, чтобы удалить любые внешние опухолевые клетки. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать использования игл.

Держите срединную сторону разреза, включая кожу и перитонеальную подкладку, кроме щипцов и используйте стерильный ватный тампон, чтобы осторожно вытащить большой и маленький кишечник, помещая их на стерильную марлю, смоченную в стерильном физиологическом растворе. Выдвиньте большой и тонкий кишечник до визуализации портальной вены.

Накройте внутренние органы в засоленной марли, чтобы поддерживать внутреннюю влажность и стерильность.

Попросите помощника, также надев стерильные перчатки, держите кишечник, завернутый в засоленную солевую марлю, осторожно с помощью стерильного тампона с хлопком, чтобы полностью открыть портальную вену. Кроме того, может потребоваться использование автоклавного гемостата или щипцов для удерживания ткани в сторону на медиальной стороне разреза.

Вставьте иглу, нагруженную опухолевыми клетками

3 — 5 мм, в портальную вену на 10 мм ниже печени под углом 10% потеря веса / усиление, извращенность, потеря внимания к окружающей среде, отеки / асцит живота, бледные глаза и уши, или сгорбленное положение. ПРИМЕЧАНИЕ. Ежедневные проверки здоровья особенно важны при разработке модели для использования с новой клеточной линией или концентрацией клеток до тех пор, пока шкала метастазов не будет хорошо понята.

В конечной точке исследования эвтаназируйте мышей с помощью ингаляции СО2 с последующей дислокацией шейки матки. ПРИМЕЧАНИЕ. Альтернативные методы эвтаназии, одобренные комитетом по надзору за исследователями, могут быть использованы, включая перфузию с 1x PBS при анестезии. Перфузию печени выполняют путем канюлирования воротной вены, срезания нижней полой вены и нажатия 1x PBS через сосудистую сеть печени со скоростью 4 мл / мин в течение 1 — 2 мин для удаления циркулирующей крови и лейкоцитов. ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от конечной точки исследования, клеточной линии и используемой концентрации явная метастазирование печени может быть или не быть очевидным при вскрытии. Микрометастатические поражения могут быть выявлены при гистологическом анализе печени. Конечные точки будут меняться в зависимости от дизайна исследования.

Извлеките печень ножницами и щипцами, сначала удалив желчный пузырь, затем прорежьте нижнюю полой веной, превосходящую печень. Вырезать полой вены, воротной вены и печеночной артерии ниже печени.

Осторожно удалите всю печень и вымойте 5x в 1x PBS.

Отделите печень на левые, правые, срединные и хвостатые дольки.

Формалин фиксирует печень в 10% нейтральном буферном формалине в течение 48 ч при встряхивании при комнатной температуре. Обрабатывать ткани через ряд спиртов с увеличением концентрации и ксилола; парафин встраивает фиксированную ткань71. ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы печень можно замораживать, помещая ткань в криомолью с оптимальной формующей температурой (OCT) и замораживанием на сухих ледяных гранулах, погруженных в 95% этанол. Используя микротом, нарежьте в парафиновый внедренный тканевый блок таким образом, чтобы был выявлен размер ткани в спичечной головке.

Вырезать пять последовательных секций с 4 микронами, это первый уровень анализа.

Обрежьте 250 микрон ткани, выбросьте эти секции в отходы.

На 250 мкм срезают второй уровень из пяти 4-микронных сечений.

Повторяйте, если необходимо, для отделения всей печени. Гематоксилин и эозин окрашивают первую часть каждого уровня для оценки метастазов72. ПРИМЕЧАНИЕ. Для оснащенных замораживанием тканей используйте криостат для срезанных участков. ПРИМЕЧАНИЕ. Обнаружение микрометастатического заболевания потребует окрашивания опухолевых клеток.

Удалите мышей из исследования, если на участке разреза наблюдается рост опухоли, так как это указывает на утечку опухолевых клеток в перитонеальную полость после инъекции. ПРИМЕЧАНИЕ. Эта проблема не наблюдается.

Модель инъекции вентральной вены, в которой опухолевые клетки доставляются непосредственно в печень с помощью хирургической процедуры, позволяет вводить опухолевые клетки в портальную вену. В антисептических условиях у анестезированной мыши 1-дюймовый хирургический разрез делается с левой стороны мыши между срединной и сагиттальной плоскостями, начиная чуть выше плоскости четвертого пахового молочного соска и заканчивается чуть ниже ребер , Большой и тонкий кишечник осторожно тянут через разрез, чтобы обеспечить визуализацию воротной вены (рис. 1А). Точная анатомическая идентификация воротной вены и успешная внутрипортальная инъекция могут быть подтверждены практикой протокола инъекции с индийскими чернилами или аналогичным красителем. Правильная инъекция через воротную вену приведет к тому, что чернила будут доставлены немедленно и, в частности, в печень, и это не приведет к распространению чернил в Индии (рис. 1B). Кроме того, с использованием D2A1 мышиных опухолевых клеток молочной железы, меченных GFP, рассеивание опухолевых клеток по всей печени проявляется через девяносто минут после инъекции, что подтверждает доставку инъекций венковой вены в печень (рис. 1C). При более высоком увеличении становится очевидным, что через 90 мин после инъекции опухолевые клетки обнаруживаются внутри синусоидов, а также внутри паренхимы печени в непосредственной близости от портальных триад, где кровь воротной вены входит в печень (рис. 1С). Эти данные свидетельствуют о том, что активная экстравазация опухолевых клеток происходит через 90 мин после инъекции опухоли. Взятые вместе, эти данные подтверждают, что модель инъекции венозной вены обеспечивает объем инъекции непосредственно в печень, при этом чернила или опухолевые клетки рассеиваются по всей печени и не имеют заметной транспортировки объема инъекции в легкие.

Для оценки надежности модели инъекции воротной вены три отдельные линии клеток опухолевых клеток молочной железы мыши были протестированы у взрослых самцов Balb / c. Эти линии опухолей молочной железы были выбраны на основе их охарактеризованного поведения в моделях молочной железы молочной железы и включают высокоагрессивную и метастатическую клеточную линию 4T1, менее агрессивную метастатическую линию D2A1 и низкую / неметастатическую линию D2.OR37,61,73, 74. 2000 и 10000 клеток на инъекцию были испытаны без заметных различий во времени развития открытого метастазирования с этими низкими концентрациями клеток. Для этих исследований использовались суррогатные маркеры метастазирования, такие как отсутствие ухаживания, бледности и потери веса для оправдания вскрытия, при которых наличие или отсутствие метастазов в печени подтверждалось визуальной оценкой печени и других органов для подтверждения внутрипортальной доставки , Эти данные подтверждают предыдущие сообщения о том, что клеточные линии 4T1 и D2A1 представляют собой более агрессивные линии опухолей молочной железы, поскольку наблюдаются более короткие показатели выживаемости метастазов по сравнению с мышами, которым вводили менее агрессивную линию D2.OR (рисунок 2A). У мышей, инъецированных опухолевыми клетками 4T1 или D2A1, были развиты метастазы в метастазы печени через 30-40 дней после инъекции, а некоторые развились метастазы уже через 18 дней после инъекции (рисунок 2A), тогда как только одна мышь, инъецированная клетками D2.OR, развили явную метастазию печени по окончании исследования, которая была через 60 — 65 дней после инъекции опухоли. Метастазы впоследствии подтверждались путем секвенирования печени на уровне 250 мкм и анализа окрашенных гематоксилином и эозином (H & E) (рис. 2B-D).

В дополнение к обнаружению явных метастатических поражений в печени мыши модель портальной вены также может быть использована для изучения ранних событий в метастатическом каскаде, включая обнаружение одиночных клеток / клеточных кластеров после экстравазации и формирование микрометастатических поражений. Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание использовалось для обнаружения опухолевых клеток 4T1, D2A1 и D2.OR молочной железы в печени, когда они присутствуют в виде отдельных клеток или микрометастатических поражений, поскольку H & E недостаточно для подтверждения наличия небольших повреждений. На фиг. 3А показана репрезентативная мышь Balb / c мыши с предполагаемыми микрометастатическими очагами опухолевых клеток D2A1, которые являются положительными для эпителиального кератина CK18, отрицательным для пан-иммунного маркера CD45 и отрицательным для гепатоцитарного маркера Heppar-1. Гепатоциты также окрашивают положительный результат для CK18, что требует использования Heppar-1 в этой окрашивающей панели. Важно отметить, что эпителий желчных протоков и клетки-предшественники печени окрашиваются положительно для CK18, что требует тщательной дискриминации между опухолевыми клетками и желчными протоками, особенно при оценке перипортальных областей (рис. 3A). Альтернативой мультиплексной иммунофлюоресценции для идентификации одиночных диссеминированных клеток и микрометастатических очагов является использование сингенных линий опухолей молочной железы, меченных улучшенным зеленым флуоресцентным белком (eGFP) и / или люциферазой, и выполнение IHC для метки (рисунок 1C). Из-за иммуногенности eGFP, люциферазы и других белков важно использовать мышиные модели, которые переносятся на эти белки, такие как новая иммунная компетентная «светящаяся головная» мышь, которая экспрессирует eGFP и люциферазу в передней гипофизе 75. Для идентификации макрометастатических поражений немаркированных сингенных линий, таких как линия опухоли D2A1, мультиплексированная иммунофлюоресценция CK18 / Heppar-1 / CD45 является идеальной (рис. 3B).

Рисунок 1: Инъекция портальной вены вызывает опухолевые клетки непосредственно в печень. A) инъекция портальной вены; разрез делается между срединными и левыми сагиттальными плоскостями, сверху плоскости четвертого пахового молочного соска и заканчивается чуть ниже грудной клетки. B) Печень Balb / c с инъекцией PBS (слева). После индийской инъекции чернил через портальную вену, печень (средняя), но не легкая (справа) принимает чернила. C) Репрезентативные изображения тонких срезов опухолевых клеток мыши D2A1 мыши, помеченных GFP в печени мыши Balb / c, через 90 минут после инъекции 1 × 106 опухолевых клеток через портальную вену. Печени фиксировали формалином, вставляли парафином, секционировали и окрашивали анти-GFP-антителом для обнаружения опухолевых клеток. Верхняя панель показывает темно-коричневые окрашенные опухолевые клетки (стрелки), диспергированные по всей печени, звездочка обозначает неспецифическое окрашивание гепатоцитов вокруг центральных вен; шкала шкалы = 300 мкм. Нижние панели показывают репрезентативные изображения опухолевых клеток через 90 мин после инъекции, которые все еще тесно связаны с сосудистой сетью; шкала шкалы = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Выраженность линий клеток опухоли мышей молочной железы в печени после инъекции венковой вены. A) Кривая Каплана-Мейера, показывающая показатели выживаемости без метастазов у мышей, которым вводили 2 000-10 000 клеток опухоли мышиной опухоли мыши 4T1, D2A1 или D2.OR. Мышам вводили опухолевые клетки и наблюдали за признаками метастаза, включая отсутствие ухода, бледные глаза и изменения веса. Метастазы были подтверждены во время вскрытия и H & E на гистологических отделах печени. N = 2 4T1 2000 клеток; 2 4T1 10000 клеток. N = 2 D2A1 2000 клеток; 3 D2A1 10000 клеток. N = 3 D2.OR 2000 клеток; 3 D2.OR 10000 клеток. Репрезентативные H & E-изображения B) 4T1-повреждений в 21 день после инъекции 10 000 клеток, C) повреждения D2A1 через 26 дней после инъекции 10 000 опухолевых клеток и D) повреждения D2.OR через 59 дней после инъекции 10 000 клеток; шкалы шкалы = 75 мкм. Подобные поражения наблюдаются, когда вводили 2000 опухолевых клеток 4T1 или D2A1. Не обнаружено никаких повреждений с 2000 клетками D2.OR. Никакие признаки метастазов в других органах или на месте хирургического разреза не были очевидны у любой мыши в этих исследованиях. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Обнаружение одиночных клеток и метастатических поражений в мышечной печени с использованием мультиплексной иммунофлюоресценции. A) Репрезентативная мультиплексная иммунофлуоресценция опухолевых клеток D2A1 в печени мыши Balb / c через 90 мин после инъекции с использованием модели инъекции вентральной вены. Окрашивание проводили с использованием набора мультиплексов. Слева направо показаны DAPI; CD45 для маркировки лейкоцитов; Геппера-1 для обозначения гепатоцитов; и CK18 для обозначения опухолевых клеток, гепатоцитов и эпителия желчных протоков. Объединенное изображение показывает предполагаемый кластер опухолевых клеток CK18 + Heppar-1-CD45-D2A1, тесно связанных с портальной триадой. Arrow = D2A1 опухолевые клетки, звездочка = эпителий желчных протоков; шкала шкалы = 25 мкм. B) Репрезентативное обнаруженное метастатическое поражение D2A1 с использованием той же окрашивающей панели, что и в A. Опухолевые клетки являются CK18 +, тогда как соседние гепатоциты являются CK18 + Heppar-1 +; шкала шкалы = 25 мкм. Изображения были зафиксированы на микроскопе с объективом 20 x 0,8, 40 x 1,3 и 60 x 1,4 и камерой CCD с использованием программного обеспечения для микроскопа. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Модель инъекции мышиной мышиной вены Balb / c позволяет изучать повреждения молочных желез в печени в отсутствие смешения многоорганических метастазов и полностью иммунного компетентного хозяина. Наш протокол — это продвижение ранее опубликованных хирургических процедур, которые позволяют получить доступ к воротной вене для инъекции опухолевых клеток непосредственно в печень16,55,56. Одно продвижение, которое мы сделали, — значительно сократить количество инъецированных опухолевых клеток от ≥ 1 × 105 клеток / инъекцию16,55,56 до ≤ 10 000 опухолевых клеток / инъекцию. Мы также расширили модель исследования метастазов рака молочной железы в печени. Используя этот протокол, две линии клеточного рака молочной железы с известным метастатическим потенциалом развивают метастазы в печени с более короткой латентностью, чем более спокойная линия клеток опухоли молочной железы. Кроме того, в ранние моменты времени опухолевые клетки распределяются по всей паренхиме печени как отдельные или небольшие группы отдельных клеток после инъекции опухолевых клеток. Модель готова решать вопросы метастатической эффективности, включая экстравазацию опухолевых клеток, выживаемость клеток, покоя и пролиферацию — все фенотипы, которые способствуют развитию микрометастатической и открытой метастатической болезни в печени.

Важно рассмотреть многочисленные аспекты протокола введения вены в вену до начала исследований. Настоятельно рекомендуется тщательное определение клеточных линий, концентрации клеток, общего количества клеток и конечных точек, основанных на небольших исследовательских исследованиях. Кроме того, использование иммунных компетентных хозяев и линий сингенных клеток имеет первостепенное значение для понимания взаимодействия клеток-опухолевых клеток. Недавно разработанная «светящаяся головная» мышь, которая экспрессирует eGFP и люциферазу из передней доли гипофиза, является важным инструментом для устранения реакций хозяина на экзогенные eGFP и люциферазы, белки, которые часто используются для маркирования линий опухолей молочной железы75. Использование «светящейся головы» мыши и сингенных меченых опухолевых клеток облегчит идентификацию одиночных диссеминированных клеток и микрометастатических очагов с помощью IHC без беспокойства по поводу воспалительных реакций на eGFP или люциферазу. Аналогичным образом, настоятельно рекомендуется выбирать стратегии управления болью, чтобы гарантировать минимальное противоопухолевое воздействие от режима лечения наркотиками. Критические шаги в этом протоколе включают поддержание стерильных условий во всех операциях, чтобы гарантировать, что инфекция не произойдет, так как это приведет к смещению любых результатов. Также важно, чтобы игла правильно помещалась в воротной вене, чтобы обеспечить доставку опухолевых клеток в печень. Практика протокола с красителями, такими как индийские чернила, поможет в этом вопросе. Рост опухоли на участке разреза кожи является лучшим показателем того, что произошло неправильное размещение иглы. Наконец, очень важно, чтобы кровопотеря из воротной вены адекватно контролировалась и полностью прекращалась до ушивания животного. Использование гемостатической марли значительно снижает риск неконтролируемой кровопотери из портальной вены после инъекции. В наших руках связанная с процедурой смертность из-за потери крови из воротной вены после инъекции была снижена с 30% до 2% мышей с использованием гемостатической марли.

Важно отметить, что модель инъекции вентральной вены не реплицирует полный метастатический каскад, но ограничивается изучением экстравазации опухолевых клеток, взаимодействий с опухолевыми клетками после экстравазации и роста опухоли. Срочно необходимы модели, которые точно реплицируют полный метастатический каскад в печень, например, у пациентов. Дополнительным ограничением модели инъекции венозной вены является то, что ее смешивают с воздействием операции на хозяина, причем ранное заживление, известное, влияет на прогрессирование заболевания76,77.

Модель инъекции вентральной вены представляет собой улучшение на других моделях инъекций для изучения метастазов в печени, включая внутрисердечные и внутриплодные модели. В частности, модель инъекции вентральной вены позволяет изучать больший диапазон прогрессирования заболевания, чем внутрисердечная модель, которая часто ограничена сопутствующими метастазами в других тканях. Кроме того, модель воротной вены не осложняется удалением селезенки, как это делается во внутрипластической модели.

Модель инъекции воротной вены может оказаться полезным инструментом для изучения метастазирования печени в целом. Метастаз печени — наиболее частый сайт метастазов в аденокарциномах в целом с особенно высокими показателями рака поджелудочной железы (85% метастазов в печени), кишки и ректальной аденокарциномы (> 70%), а также желудка и пищевода (> 30 %) 1. Хотя спонтанные и ортотопические первичные опухолевые модели аденокарциномы поджелудочной железы и толстой кишки легче метастазируют до печени78,79, модель инъекции воротной вены может оказаться полезной для понимания метастатического процесса этих видов рака, поскольку контролируемая доставка опухолевых клеток позволяет проводить биохимические, молекулярные и гистологические оценки в указанное время после поступления опухолевых клеток. Таким образом, модель инъекции воротной вены представляет собой важное улучшение по имеющимся метастазированным моделям рака молочной железы, а также может быть применимо к области метастазов в печени в целом.

Авторам нечего раскрывать и не объявлять конкурирующих финансовых интересов.

Авторы хотели бы выразить признательность Александре Куакенбуш за помощь в хирургических процедурах во время съемок видео-протокола Хэдли Холдена для гистологической поддержки, Сонали Джиндаля для участия в патологии опухоли и печени во время разработки метода, а Бренна Карузо — для критического обзора рукописи. D2A1 и D2.OR опухолевые клетки молочной железы были подарком от доктора Энн Чамберс, опухолевые клетки D2A1-GFP были подарком от доктора Джеффри Грина, а опухолевые клетки 4T1 были подарком от доктора Хайде Форда. Для визуализации использовался OHSU Advanced Light Microscopy Core в Центре Jungers. Работа, включенная в эту рукопись, включает финансирование от NIH / NCI NRSA F31CA186524 (до ETG) и NIH / NCI 5R01CA169175 (до PS).

источник